Characterization of plant associated AlkB-like demethylases

AlkB-proteinet hos bakterier er et enzym som reparerer, dvs fjerner, skadelige metylgrupper i cellens arvestoff. Metylerende stoffer finnes både inne i celler og i miljøet, og AlkB motvirker derfor de negative effektene av slike stoffer. Multicellulære organismer, f. eks. planter og mennesker, har flere ulike varianter av AlkB (kalt homologer, ALKBH), og flere av disse har andre roller enn å reparere DNA. I dette prosjektet brukes planten Arabidopsis thaliana som en modellorganisme for å studere funksjonen til ALKBH proteinene, og prosjektet fokuserer også på en annen gruppe enzymer, metyltransferaser, som setter metylgrupper på cellens makromolekyler, dette i kontrast til AlkB-proteiner som fjerner metylgruppene. I dette prosjektet har vi studert DNA-reparasjonsenzymet ALKBH2 (også kalt ALKBH2/3) i Arabidopsis thaliana (Meza et al., Nucleic Acids Research, 2012), og det ble vist at planter som mangler dette enzymet får utviklingsdefekter dersom de eksponeres for metylerende stoffer. Dette er en av de første studiene av planteenzymer som reparerer i metyleringsskade i DNA. Videre har vi også studert det såkalte ALKBH8-enzymet i Arabidopsis (Leihne et al., Nucleic Acids Research, 2011) som ble vist å ha en viktig rolle i modifikasjon av såkalte tRNA molekyler, en gruppe molekyler som er sentrale i cellens proteinsyntese. Som en del av prosjektet er det også gjort viktige funn om en ny famile av enzymer som plasserer metylgrupper på andre proteiner (Kernstock et al., Nature Commun., 2012; Jakobsson et al. , J. Biol. Chem., 2013; Davydova et al., J. Biol.Chem., 2014).

The AlkB protein from E. coli was some years ago shown to be an iron- and 2-oxoglutarate dependent oxygenase which catalyses the reversal of certain methyl lesions, e. g. 1-methyladenine, in DNA and RNA. In the AlkB reaction, the deleterious methyl group is first oxidised, and then spontaneously released as formaldehyde, thus regenerating the lesion-free base. Vertebrates have eight different AlkB homologues ABH), denoted ABH1-8. Two of these, ABH2 and ABH3, have been shown to reverse lesions on nucleic a cids, whereas the function of the remaining six is still elusive. Counterparts of most of the vertebrate ABH proteins are found in plants, and the proposed project will mainly focus on three different ABH proteins from the model plant Arabidopsis thaliana , denoted AtABH2/3, AtABH5/7, and AtABH8, where we have preliminary data suggesting that they are involved in DNA repair, epigenetic regulation, and tRNA modification, respectively. In the proposed project, the function of these proteins will be further characterized, both by studying recombinant proteins, as well as by phenotypic characterisation of mutant plants lacking or overexpressing these enzymes. Furthermore, some RNA viruses infecting plants have an AlkB proteins, and we have obtained results in dicating that these proteins are RNA repair enzymes involved in repairing the viral genome. As part of the proposed project, these viral AlkB proteins will be further studied, aiming to establish in more detail their role during viral infection.