BEDREHELSE-Bedre helse og livskvalitet

PhD1 Frigjøring av sporer og fragmenter fra 2 og 8 uker gamle soppkulturer av Aspergillus fumigatus (AF), Aspergillus versicolor (AV) og Penicillium chrysogenum (PC) ble studert med to generatorer, tre medier og to lufthastigheter. Det frigjøres sub-? fragmenter fra soppkulturene i tillegg til sporer, sporeaggregater og andre større partikler. Flest sub-um fragmentene stammer fra mycelium (trådformet nettverk av soppceller). I forsøkene med Aspergillus artene ble det også funnet sporefragmenter. Det ble funnet fragmenter i samme størrelse og form som sporer. Det er sannsynlig at tidligere laboratoriestudier har overvurdert frigjøring av sporer. Observasjon av fragmenterte sporer tyder også på at tidligere publiserte funn kan være basert på artefakter. To artikler er publisert i Appl Environ Microbiol og Aerosol Sci&Technol. Deteksjon av fragmenter fra mycelium samt sub-um partikler i miljøprøver krever spesifikk merking fordi disse partiklene kan mangle karakteristisk morfologi. En metode ble utviklet basert på immuno-gull merking med IgY antistoffer mot AV sporer og deteksjon med field emission scanning elektronmikroskopi i under utenlandsoppholdet i USA. Metoden er testet ut på miljøprøver tatt under renovering av fuktskader og beskrevet i en artikkel i Appl Environ Microbiol. Metoden er en viktig forutsetning for å kunne studere forekomst av mycelium fragmenter som forventes å gi allergiske effekter i luftveiene. Kandidaten forsvarte sin avhandling ved NMBU 22.5.2015 For de toksikologiske studiene er mengden av sporer fra AF og PC som kan genereres er tilstrekkelig, men ikke for AV og Stachybotrys chartarum (SC). Sporer fra AV og SC ble fremstilt ved vasking av kulturer. Også fragmenter ble generert i for små mengder og ble fremstilt ved å høste mycelium før sporedannelse, og tørke og knuse det. Finfraksjonen ble deretter samlet opp med en respirabel syklon. Hyfefragmenter og sporer ble undersøkt i hus med synlig soppvekst. I inneluft var 53% av sopp partiklene hyfefragmenter, mens det var 21% i uteluft. Kun 3% var småfragmenter (manuskript). PhD2 Sporer og hyfefragmenter fra AF, PC, AV og SC kulturer ble samlet inn, inaktivert og karakterisert mhp antall og partikkelform, og mykotoksin, b-glukan og proteaseinnhold/aktivitet. Proinflammatoriske egenskaper ble undersøkt i humane THP-1 monocytter, THP-1 makrofager og bronkiale epitelceller (BEAS-2B). Preparatene viste seg å være rene spore- eller hyfepreparater, bortsett fra sporer fra PC og SC som hadde en viss andel hyfer. Hver muggsoppart produserte hovedsakelig én type protease. Mykotoksin-nivåene var lave. ?-glukaner og proteaser ble hovedsakelig funnet i hyfene. THP-1 makrofager var mest sensitive og responderte med cytokinutskillelse på meget lave doser av AF hyfe (10 ng/cm2). Det var store potens forskjeller mellom ulike sopparter og vekststadier mhp proinflammatoriske responser, men forskjellene kunne ikke enkelt relateres til en enkelt av karakteristikaene over. AF and PC hyfer var mye mer potente en korresponderende sporer, noe som er i tråd med nåværende konsensus. Interessant nok gjaldt imidlertid ikke dette sporer og hyfer fra AV og SC. En artikkel publisert i Indoor Air 2017. En sammenligning av AF sporer og hyfer som var inaktiverte ved røntgen eller varme, versus ubehandlede viste at ingen av inaktiveringsmetodene ødela cytokin responsene. Studier av mekanismer for hvordan sporer og hyfer fra AF og AV induserer cytokinresponser i ulike makrofager THP-1, primære blod monocytt-deriverte (MDM), og lungemakrofager, er ferdigstilt. AF var klart den mest potente; og de ulike makrofagmodellene responderte kvantitativt og kvalitativt forskjellig. Responsene i MDM synes mest relevante. I MDM synes responsene fra sporer og hyfer fra AF å involvere for det meste toll-like reseptor (TLR)4 og i mindre grad TLR2 De ulike cytokinresponsene gikk alt vesentlig via samme reseptor. Manuskriptet blir innsendt i 2018. I en studie basert på sporer og hyfer fra AF og PC foretas en karakterisering av immunresponsene i lungeepitelceller. Ubehandlede AF sporer ble omdannet til hyfer raskere i nærvær med epitelceller enn uten, og førte til responser som lignet på de fra inaktiverte hyfer. Interessant nok ser responsen fra både AF og PC hyfer å gå via TLR2, og ikke via TLR4 som i makrofager. Manuskriptet blir innsendt i 2018. Kombinert eksponering av mineralpartikler og organiske komponenter (AF hyfe) førte til en synergistisk utskillelse av IL-1?. AF hyfer førte til økt syntese og produksjon pro-IL-1?, og til en viss grad også utskillelse av IL-1?. Mineralpartikler førte til en synergistisk effekt ved å kløyve proformen indusert av AF hyfer, noe som førte til en ytterligere utskillelse av IL-1?. Denne effekten ble karakterisert i THP-1 makrofager, og ble bekreftet i de andre makrofagmodellene og i lunge epitelceller. Manuskriptet er innsendt. PhD-sammendraget basert på 4 artikler er påbegynt og blir ferdigstilt i februar 2019.

Hyfefragmenter har forskjellige og til dels sterkere biologiske effekter enn sporer. Videre kan dagens måter å karakterisere inneklima mhp sopp ikke direkte overføres til biologiske responser. Flere biologiske metoder in vitro er etablert, videreutviklet og sammenlignet mhp inflammatoriske responser. Testbatteriet er nytt og klart mer relevant.Resultatene viser at dagens forståelse av sammenhengen mellom eksponering for sopp og sykdom er meget mangelfull.Målinger av sopp partikler i innemiljø med en ny metode for hyfefragmenter utviklet i prosjektet viste at en vesentlig del av sopp partiklene er fragmenter.Hyfefragmenter bør derfor kvantifiseres separat i fremtidig forskning på sammenhengen mellom eksponering for sopp partikler og helse. Prosjektet har vist at det finnes flere gode supplerende metoder for karakterisering av ulike sopp partikler som bør utprøves og utvikles videre slik at deres fulle potensiale mhp informasjon for kartlegging av inneklimaplager kommer klarere frem.

Fungal spores have obtained widespread attention as possible causal agents for adverse indoor air associated health problems. It has been reported that fungi may adversely affect human health through allergic and non-allergic airway inflammation, by infec tion and by the toxicity of mycotoxins. However, it is still not clear if spores inhaled in indoor environments really have all the adverse health implications suggested, as the indoor levels of airborne spores are often found to be too low to explain ass ociations with health effects other than allergy. Recent studies have drawn attention to fungal hyphae and smaller-sized fungal fragments as tentative causes of indoor health problems. Furthermore, experimental studies have suggested that the inflammator y properties of fungal spores are modulated by their viability showing allergic responses to viable spores and non-allergic responses to non-viable spores. However, since no method for measurement of fungal fragments exists, the airborne levels indoor and outdoor, and their toxic properties are largely unknown. Thus, possible health implications of fungal particles besides spores are still very unclear. The goals for this project are therefore to i) develop measurement methods for viable and non-viable sp ores, hyphae and fragments, ii) assess their airborne levels in a small proof-of-principle study in common indoor environments and in moisture-damaged buildings, iii) characterize these fungal particles by chemical and biological methods, and iv) study th eir toxic properties in vitro and in vivo. For this purpose, viable and non-viable spores, hyphae and fragments will be prepared from pure cultures of fungal species associated with moisture-damage in buildings. The results are expected to provide new me thods for exposure assessment of fungal particles to be used in future epidemiological studies, and new insights in the possible role that fungal growth in indoor environments may have on respiratory health.