Chemo-enzymatic production of bioactive chito-oligosaccahrides

Dette 3-års postdoktorprosjektet startet 1. oktober 2010 og ble forlenget på grunn av en permisjon i perioden oktober 2012 til juni 2014. Rapportperioden spenner fra 1. oktober 2010 - juni 2015. Prosjektet omhandler produksjon av kitosan oligomerer og deres byggesteiner med enzymatiske og kjemiske metoder, i tillegg til testing av deres biologiske aktiviteter. Arbeidet ble utført ved Norges Miljø- og Biovitenskapelige Universitetet (NMBU), Institutt for kjemi, bioteknologi og matvitenskap i Professor Vincent Eijsink gruppe, og ved professor Steve Withers karbohydratkjemi-laboratorium ved University of British Columbia (UBC), Vancouver, Canada . Hovedmålet med dette prosjektet var kjemisk-enzymatisk syntese av chitooligosaccharides (CHOS) med dokumentert bioaktiviteter. Et av hovedmålene var å produsere små CHOS med spesifikke sekvenser som kan testes som kitinase-inhibitorer, fra mindre glukosamin / GlcNAc byggeklosser, med kjemiske og enzymatiske metoder. Metoder for kjemisk-enzymatisk syntese av små CHOS-byggesteiner og oligomerer ble utviklet de to første årene av prosjektet. De kjemiske metoder ble etablert på UBC, og ytterligere optimalisert ved NMBU det siste året av prosjektet. Vi er nå i stand til å effektivt, i en laboratorieskala, produsere korte CHOS med en bestemt sekvens (vekslende GlcN og GlcNAc, DADADA, tetramerer heksamerer, oktamerer etc). Vi skal videre teste disse spesifikke CHOS som hemmere av kitinaser. Testing av bioaktiviteter av spesifikke blandinger av CHOS produsert med enzymatiske metoder var en viktig del av dette prosjektet. Et samarbeid med Chinese Academy of Science resulterte i en publikasjon i Carbohydrate Polymers i 2012. (Wu H., Aam B.B., Wang, W., Norberg A.L., Sørlie M., Eijsink V., Du Y. (2012). Inhibition of angiogenesis by chitooligosaccharides with specific degrees of acetylation and polymerization. Carbohydrate Polymers 89(2): 511-518.) Vi testet evnen til CHOS, produsert i dette prosjektet, til å hemme utviklingen av blodårer, en prosess som kalles angiogenese. CHOS hemmet denne prosessen signifikant. Dette funnet kan benyttes ved behandling av kreft, for å hemme veksten av tumorer som er avhengig av at nye blodårer dannes. I 2013 publiserte vi en artikkel om CHOS sin evne til å binde til patogene bakterier i tarmen. Når CHOS binder til bakteriene forhindrer man samtidig at de binder til og invaderende epitelceller som er første steg i sykdomsutvikling. Dette var et samarbeid med University of Nebraska. (Quintero-Villegas M.I., Aam B.B., Rupnow J., Sørlie M., Eijsink V.G., Hutkins R.W (2013) Adherence inhibition of enteropathogenic Escherichia coli by chitooligosaccharides with specific degrees of acetylation and polymerization. J Agric Food Chem. 61 (11) 2748-2754) En annen viktig egenskap til CHOS er evnen til å hemme vekst av sopp og vi har testet for veksthemming av plantepatogene sopp. Dette arbeidet har resultert i en patentsøknad og to publikasjoner. (Rahman M.H., Shovan L.R., Hjeljord L.G., Aam B.B., Eijsink V.G., Sørlie M., Tronsmo A. (2014) Inhibition of Fungal Plant Pathogens by Synergistic Action of Chito-Oligosaccharides and Commercially Available Fungicides. PLoS One 25;9(4):e93192 og Rahman M.H., Hjeljord L.G., Aam B.B., Sørlie M., Tronsmo A. (2015) Antifungal effect of chito-oligosaccharides with different degrees of polymerization, European Journal of Plant Pathology 141:147-158.) I tillegg har vi startet et selskap, BioCHOS (www.biochos.com) som utvikler et CHOS- fungicid til bruk på planter i landbruket. Denne anti-sopp effekten har også blitt testet for flere mulige anvendelser.

Chitosan, a linear heteropolymer consisting of beta(1-4) linked N-acetylglucosamine (A) and glucosamine (D), can be converted to chito-oligosaccharides (CHOS) with different lengts and sequences by hydrolyzing certain types of chitosan with tailored chiti nases or chitosanases. The resulting CHOS have a variety of interesting bioactivities, including imunomodulary, anti-inflammatory (in f.ex. asthma), and anti-fungal activities. CHOS may also act as elicitors in plant cell defence responses and stimulate b one cell growth. Application of CHOS is hampered by several interrelated factors: (1) It is difficult to produce specific, oligomeric CHOS; (2) CHOS may be too unstable in e.g. the human body and/or bioactivity may be too low; (3) the molecular basis for CHOS functionality has not been sufficiently explored. Building on technology for controlled enzymatic conversion of chitosan that has recently been established in the applicant's laboratory, the present project aims at alleviating all these three limitin g factors by tackling some of the fundamental scientific challenges underlying them. We will: (1) Use innovative enzyme technology to generate specific oligomeric CHOS out of shorter CHOS building blocks that we can produce in-house; this will include the use of enzymes that are tailored to increased transglycosilation efficiency, as well as glycosyntase technology; (2) Chemically modify CHOS to increase their stability and/or bioactivity; (3) Set-up and use a series of biological tests to analyze bioacti vity of highly-defined CHOS preparations. Much of the advanced carbohydrate chemistry and the work on glycosyntase technology are going to be carried out during a one year stay of the project post-doc in the group of Professor Stephen G. Withers at the Un iversity of Brithish Columbia, Vancouver, Canada. Applied studies will be conducted through several collaborations with UMB, Norwegian and foreign laboratories.