Impact of animal stress on eating quality of beef studied by cell model systems (209752)

Vi har etablert protokoller for isolering, dyrking og differensiering av muskelceller fra storfe og testet ut forskjellige overflatebehandlinger av dyrkingsflaskene med ulike bindevevskomponenter som laminin, kollagen, glykosaminoglykaner (GAGs), entactin og blandinger av disse. De bovine cellene vokser raskest og modnes bedre på en blanding av ulike bindevevskomponenter. For å simulere post mortem prosesser i kjøtt har vi fjernet oksygentilførselen til cellene ved bruk av oxyrase. Dette reduserer oksygen i mediet til under 1% mot normalt ca 18%. Muskelcellene uttrykker flere markører for apoptose etter 2-6 timers oxyrasebehandling, og våre funn tyder på at mitokondriene og cytochrom C er sentrale for denne utviklingen. Proteoglykaner på celleoverflaten er viktige for signaloverføring mellom muskelcellene og den ekstracellulære matriksen. Vi ser at proteoglykanet syndecan-4 samlokaliserer med beta1 Integrin både i prolifererende celler og i differensierte celler. I prolifererende celler finner vi syndecan-4 både på cellemembranen og perinukleært, men i løpet av differensieringen endres lokaliseringen, og vi ser at både syndecan-4 og beta1 Integrin er lokalisert i kjernemembranen tidlig i differensieringen. Når vi slår ut syndecan 4 med RNAi ser vi at dette påvirker uttrykket av muskelmarkører som actin og beta1 Integrin. Beta-Integrin lokaliseres også rundt kjernemembranen ved muskeldifferensiering. Dette synes imidlertid ikke å være avhengig av Syndecan-4, siden vi i Syndecan-4 knock-down celler fremdeles ser re-lokalisering av ?-Integrin i kjernemembranen i differensierte celler. Det er etablert et samarbeid med Oslo Universitetssykehus Ullevål. De har utviklet peptider som spesifikt blokkerer deler av Syndecan 4. Ved bruk av et slikt peptid oppdaget vi at ved å blokkere den cytoplasmiske delen av Syndecan 4 ble fusjonering av muskelceller blokkert. Videre har vi samarbeidet tett med OUS Rikshospitalet som har utført immuno-EM på lokalisering av syndecan-4 ved muskel differensiering. Denne metoden har bekreftet intracellulær og kjernelokalisering av syndecan-4 ved differensiering. Våre forsøk viser at syndecan-4 fraktes til kjernen fra plasmamembranen via endocytose. Det kan se ut som syndecan-4 kløyves, for extracellulær del er lokalisert perinukleært, mens intracellulær del finner vi inne i selve kjernen. Proteomikkanalyser av muskelcellekulturer ved bruk av LC-MSMS har blitt etablert. Proteiner ekstraheres fra cellene og behandles med en spesifikk enzymcocktail som bryter ned proteinene til mindre peptider. Disse peptidene blir så separert ved hjelp av HPLC, før størrelsen og sekvensen til peptidene blir analysert ved hjelp av et Q Exactive? Hybrid Quadrupole-Orbitrap massespectrometer. Dataene fra denne analysen blir videre analysert ved hjelp av analysepakken MaxQuant. I alt greier vi å identifisere og kvantifisere ca. 1000 proteiner i hver prøve. Ved bruk av denne analysen får vi blant annet informasjon om proteiner som er involvert i blant annet celleproliferasjon, differensiering, stress-respons, metabolisme i tillegg til strukturelle proteiner. Prøver fra cellekulturforsøk hvor vi har fjernet oksygentilførselen ved bruk av oxyrase er nå under analyse ved hjelp av denne metoden.

For the industry a predictable meat quality is essential, with tenderness, juiciness, binding properties and shelf-life being the most important quality attributes. Animal welfare and stress before slaughter are important both from an ethical point of vie w, but also for the subsequent eating quality of meat and meat products. In addition, ante- and post-slaughter conditions such as genetics, feeding, rearing conditions, transport, slaughter conditions, and post mortem handling of the carcasses and cuts wi ll affect the subsequent eating quality. Still, there is an expressed need for more knowledge on the responses to these stressors at the cellular and molecular level. Using muscle cell cultures as models for an increased understanding of these responses h as gained attention in the scientific community over the last few years. Understanding the fundamental cellular mechanisms in relation to these stressors will provide us with the tools that are crucial in selection of animals for breeding that are robust towards stress, have a desired muscle growth and finally also produce meat of good quality. We want to explore the cellular and molecular events occurring in the ante- and post mortem muscles relevant for final meat quality using cell culture models. Thi s will provide detailed information without including animal experiments that could otherwise have ethical constraints. To our knowledge this has not been studied in bovine muscles. The understanding of the molecular events will be important for the unde rstanding of animal stress, which in turn affects meat quality and muscle growth.