Inflammatory, genotoxic and tumorigenic effects of multi-walled carbon nanotubes with emphasis on the interleukin-1 family

1) In vivo dyrestudier i IL1-KO mus Vi har jobbet med 28 dagers eksponerings forsøket av IL1-WT og IL1-KO mus som vi utførte i 2014. Vi har ekstrahert totalt RNA fra blod, lunger, lever og pleura fra disse musene. Vi har sett nærmere på mRNA nivåene i sammenslåtte prøver fra lunge, pleura og blod på et PCR array spesifikk for gener innen fibrose for å finne gener med en ekstraordinær regulering. 13 gener involvert i fibrose ble valgt for videre forskning. Vi har laget primere for disse og holder nå på å kjøre qPCR for disse genene på de individuelle prøvene fra hver enkelt mus. I tillegg har vi kjørt serum prøver fra disse musene på en cytokine array for å detektere mengden protein ved hjelp av Luminex teknologi. Prøver fra de forskjellige vevene ble også tatt for histologi og vi holder på å se nærmere på disse. Arbeidet med denne delen av prosjektet har blitt forsinket på grunn av at vi måtte prioritere det større dyreforsøket innen tumorutvikling i musene som følge av nanopartikkel eksponering. Hvis det er nok midler kommer en PCR array til å bli brukt for å detektere ekspresjon av miRNA i museprøvene. Til slutt vil data fra qPCR, protein nivåer i serum, og histologi summeres opp i et manuskript som skal publiseres. I mai 2015 injiserte vi 192 mus med kontroll media eller to doser av to typer karbon nanorør for det lange tumorutviklings forsøket. 8 til 10 uker gamle vill type mus (N=91) og IL1-KO mus (N=91) ble delt i tre grupper for hver genotype. Gruppe 1 (N=38) ble injisert i pleura med enten 5 µg/mus (n=19) eller 50 µg/mus (n=19) med Mitsui-7 karbon nanorør; Gruppe 2 (N=38) ble injisert i pleura med enten 5 µg/mus (n=19) eller 50 µg/mus (n=19) med NM401 karbon nanorør og Gruppe 3 (N=15) ble injisert i pleura med bare dispergerings løsning. Musene ble nøye observert flere ganger i uken og ved tegn til sykdom eller ubehag ble de avlivet for eksperimentet. Blod og prøver fra milt, lever, nyre, pleura, lunge og hjerte ble tatt fra hver mus for RNA ekstraksjon og for histologi. Etter seks måneder hadde mesteparten av musene injisert med den høyeste dosen (50 µg) tegn til ubehag og sykdom, og det ble besluttet å avslutte eksperimentet. I løpet av november ble alle mus avlivet og prøver ble tatt. Erfaringene og resultatene fra det korte museforsøket vil hjelpe i å gjøre analysene for det lange forsøket. Dette vil til slutt føre til en publikasjon. 2) In vitro eksponering av IL1-KO museceller Vi brukte museceller fra Balb/c IL1-KO mus som mangler begge IL1 gener. Etter eksponering med de to forskjellige typene karbon nanorør var IL1-KO celler mindre sensitive enn IL1-WT celler. Vi observerte også at mengden apoptotiske celler var avhengig av tilstedeværelse av IL1. I tillegg ble nivåene av de to mitogen-activated protein kinases extracellular regulated kinase (ERK) og c-Jun N terminal kinase (JNK) regulert forskjellig. Artikkelen som viser disse resultatene ble akseptert for publisering i tidsskriftet Cytokine og ble publisert i mai 2015. Vi har fortsatt å jobbe med intercellulær kommunikasjon via gap junctions i de samme celle typene. Ved hjel av en skrape teknikk har vi vist at intercellulær kommunikasjon minsker etter eksponering for karbon nanorør og at dette var uavhengig av IL1 eller type karbon nanorør. De tre forskjellige connexinene Cx43 (Gja1 i mus), Cx26 (Gjb2 i mus) og Cx32 (Gjb1 i mus) var regulert forskjellig på mRNA og protein nivå da vi så på dette ved hjelp av qPCR, western blotting og immunofluorescent farging fulgt av laser skanning mikroskopi. Siden begge karbon nanorør som ble brukt er toksiske og reduserer celle overlevelse, tror vi at reduksjonen i intercellulær kommunikasjon kan være viktig for å inhibere overføring av overlevelses signaler mellom celler. Disse dataene har blitt summert opp i et manuskript og har blitt sendt til Journal of Cell Communication and Signaling. 3) Eksponering av humane lunge epitel celler Vi har fått data på toksisiteten av n-Tec og Mitsui-7, og har videre sett på gen og protein ekspresjon av connexin genene Cx43, Cx26 og Cx32 som er viktige for intercellulær kommunikasjon. Skrape teknikken og laser skanning mikroskopi har blitt brukt for å detektere kommunikasjon mellom cellene. Dataene fra disse forsøkene krever videre verifisering før et manuskript kan skrives. Vi har i tillegg laget og verifisert en stabil IL1 knock-down human lunge celle linje. For disse cellene planlegger vi å gjøre COMET assay etter eksponering for karbon nanorør. Dessverre har dette arbeidet blitt forsinket grunnet det at vi måtte prioritere det større dyreforsøket innen tumorutvikling i musene som følge av nanopartikkel eksponering. Vi håper allikevel å få fullført disse eksperimentene i 2016.

The engineered nanomaterials (ENM), including carbon nanotubes, are becoming a part of our daily life as they are used in manufacturing of hundreds of products in food packaging, sporting, cosmetics, clothing, electronics, aerospace, and for medical purpo ses. The ENM may also enter the environment through various routs such as waste release by production industries or by personal and health care consumer products. The exposure of humans to ENM may occur through inhalation, ingestion, dermal contact and sy stemic administration. There is growing concern about the risk and hazards posed by engineered carbon nanotubes (CNT) as these are the most common ENMs found in consumer products. Potential human adverse health effects include lung fibrosis, cancer, cardi ovascular diseases and enhanced allergy where inflammation plays a key role. The main goal of the proposed project is to investigate the hazard posed by the engineered multi-walled CNT (MWCNT) as these are widely manufactured and used in several nanoprodu cts. In aim I, we will specifically study MWCNT related 1) inflammation 2) genotoxicity and 3) tumorigenesis in a mouse model lacking the proinflammatory gene interleukin-1. In aim I we will use two MWCNTs to expose the IL-1 KO and WT mice in order to stu y: Tumor induction, inflammatory biomarkers, genotoxic/mutagenic effects and non-genotoxic effects effects. In aim II we will expose WT and IL-1 deficient human lung cells to study cellular and molecular mechanisms including 1) Genotoxic/mutagenic effetcs such as gene and miRNA expression changes, DNA damage /DNA adducts, mutations/chromosome aberrations, protein modifications, inflammatory biomarkers 2) Non-genotoxic effects such as DNA methylation, histone acetylation and cell-cell communication. Togeth er, the results generated by the proposed project will generate useful knowledge for safe handling of products and materials containing MWCNT and may have positive effects on decisions by regulatory authorities.