Biololgical methane oxidation by methanotrophic Verrucomicrobia under hot and acidic conditions; evolution of an ancient metabolic trait

Methylacidiphilum representerer en ny utviklingslinje av ekstremofile metanoksyderende bakterier tilhørende fylumet Verrucomicrobia. Disse bakteriene er ekstremt acidofile (syreelskende) og vokser i geotermale miljø med pH ned til 1 og under. De er moderat termofile (varmeelskende). Gruppen er fjernt beslektet med de «klassiske» metanotrofe Proteobakteriene som er utbredt i mange naturlige miljø. Oppdagelsen av metanotrofe bakterier innenfor Verrucomikroba-fylumet for noen få år siden har kastet nytt lys over evolusjonen og diversiteten av biologisk metanoksydasjon. Disse bakteriene har 3 ulike men konserverte genkomplekser som hver koder for nøkkelenzymet, partikulær metan monooxygenase (pMMO). Dette enzymet består av 3 ulike subenheter, PmoC, A og B, som sammen danner et flerkomponent enzymkompleks. En av målsettingene i prosjektet er å forstå rollen til de tre ulike genkompleksene ved å bruke bakterien Methylacidiphilum kamchatkense stamme Kam1 som modellorganisme. Vi har vist at ett av disse kompleksene, pmoCAB2 operonet er mye sterkere uttrykt enn de andre to under vanlige dyrkningsbetingelser, som viser at disse genkompleksene sannsynligvis har ulike funksjoner og uttrykkes onder ulike vekstbetingelser. Vi har arbeidet videre med denne problemstillingen og testet ekspresjon av de andre to operonene, men foreløpig har vi ingen klare resultater som kan gi informasjon om under hvilke betingelser de andre to operonene uttrykkes. Proteomikkanalyser med sikte på identifikasjon av pMMO subenheter under ulike vekstbetingelser har vært vanskelig å utføre, noe som kan skyldes tekniske problemer med trypsinering av integrerte membranproteiner, men foreløpige resultater støtter opp under transkripsjonsanalysene, dvs. at pmoCAB2 operonet er det funksjonelle genkomplekset under vanlige vekstbetingelser. Det tilsvarende enzymet (pMMO) fra metanotrofe Proteobakterier bruker kobberioner som et essensielt metall i sitt aktive senter for oksydasjon av metan til metanol. Høye kobberkonsentrasjoner er også nødvendig for ekspresjon av pmo genene. Metanotrofe Verrucomikrobier er isolert fra geotermale områder med relativt lite kobber, og kobber synes å spille mindre rolle for disse organismene enn for proteobakteriene. Vi har lykkes med å få stamme Kam1 til å vokse uten kopper-tilsetning til mediet. Dette styrker våre tidligere antydninger om at metanoksydasjonen hos denne organismegruppen kan være kobber-uavhengig og kanskje benytte et annet metall enn kopper, noe vi må undersøke nøye vha. biokjemiske analyser av metanoksydasjonsaktiviteten i nærvær av diverse metallioner. Dette støttes også av det faktum at kobber-bindings motivet som er identifisert i pMMO fra proteobakterier ikke finnes i pMMO fra verrukomikrobier. Homologimodellering indikerer også at kobber ikke bindes av pMMO fra verrukomikrobier. Et domene fra pmoB2 subenheten fra Kam1 som antas å inneholde det aktive setet for metanoksydasjon (basert på studier av metanotrofe proteobakterier) er blitt klonet og overuttrykt i E. coli. Domenet er imidlertid uløselig, men vi har i det siste klart å få det delvis solubilisert ved å lage et fusjonsprotein. Forsøk på å bruke dette i enzymatiske tester er under arbeid. Vi har laget kanin-antistoffer mot det rekombinante pmoB2 proteinet ved å bruke uløselig protein som antigen og vi har nå et godt og spesifikt antistoff mot dette domenet. Antistoffet er prøvd ut i immunogold-labelling forsøk for å fastslå den sub-cellulære lokaliseringen av Pmo-enzymet i Kam1, og foreløpige analyser tyder på at enzymet er assosiert med cellemembranen. Et annet delmål i prosjektet var å isolere nye metanoksiderende bakterier tilhørende fylumet Verrucomicrobium i den hensikt å kunne utføre biogeografiske og evolusjonsmessige analyser. Vi har nå flere nye isolater fra flere geografisk adskilte geotermale områder; Azorene, Yellowstone National Park (USA), Island og Filipinene. Isolatene er svært like, både fysiologisk og morfologisk, og med hensyn til fylogenetiske markørgener. Resultatene tyder på at det eksisterer en biogeografisk struktur der den fylogenetiske forskjellen kan korreleres med geografisk avstand. Genomet til stamme Kam1 er sekvensert til draft-nivå og sammenlignet med de andre isolatene. I hovedsak bekrefter analysen en høy grad av spesialisering mot en-karbon metabolisme og assimilering av karbon i cellenes biosynteseveier ved bruk av Calvin-Benson-Bassham syklusen slik som hos planter og andre autotrofe organismer. Disse organismene har derved en karbonmetabolisme som kan beskrives som en slags «autotrof» metanotrofi da de assimilerer karbon fra karbondioksid dannet fra oksidasjon av metan.

Recent isolation of thermoacidophilic methane-oxidizing bacteria belonging to the Verrucomicrobia lineage of evolution has expanded our understanding of the diversity of biological methane oxidation. These microorganisms share the unique ability to use me thane, a potent greenhouse gas, as a sole carbon and energy source. Methylacidiphilum kamchatkense, strain Kam1, which my lab isolated from an acidic hot spring in Kamchatka, Russia, will be used as a model for further molecular and physiological analyses of methane oxidation in these organisms, which possess 3-4 conserved operons each encoding 3 particulate methane monooxygenase (Pmo) protein subunits. Preliminary analyses indicate that only one is functionally expressed in Kam1 under standard growth con ditions. Through further transcriptional and proteomics analyses, the effect of environmental factors, such as substrate limitation and available copper, on the expression of pmo operons will be assessed as well as the mechanisms for operon regulation. Th e intracellular polyhedral bodies in these organisms are of particular interest; they may represent a novel subcellular micro-compartment for methane oxidation, compensating for the lack of the typical Pmo-associated intracellular membrane system found in other methanotrophs. These unique intracellular structures may also play a role in detoxification and/or carbon assimilation. The organelles will be purified from Kam1 and their functional role will be assessed. The diversity and activity of methanotroph ic Verrucomicrobia populations from other geothermal regions will also be explored, in part, through international collaboration. Results from this project will provide novel insights into the evolution and diversity of biological methane oxidation, a pre sumed "ancient" metabolic trait and key process in curbing natural greenhouse gas emissions.