Cell-to-cell communication: Mechanism of tunneling nanotube formation and function

1)Vi undersøkte hvordan filopodier utvikler seg til nanorør. Myosin X, et motorprotein, ble vist å være en integral del av nanorør. Myosin X induserte filopodier og samlet adhesjons molekyler på tippen av filopodier og berøringsstedet mellom nanorør og celle. Myosin X knockdown og ekspresjon av dominante mutanter hadde motsatt effekt. Andre proteiner ble fjernet fra den distale enden av nye nanorør. Sterk ekspresjon induserte filopodier, men hemmet nanorør dannelse. Et annet protein ble derimot rekruttert til nye nanorør, og ser ut til å være nødvendig til å stabilisere nanorør. Vi konkluderer at selv om nanorør utvikler seg fra filopodier blir det til en særegen F-aktin basert struktur. Resultatene skal publiseres som "Transformation of filopodia into tunneling nanotubes involves attenuation of actin dynamics and adherens junction assembly?, Ivan Rios-Mondragon, Julia Schölermann, Nickolay Bukoreshtliev, Xiang Wang, Richard Cheney and Hans-Hermann Gerdes (Manuskript er i revision i Journal of Cell Science). 2) Endring av Cadherin ekspresjon viste seg til å ha effekt på intercellulære forbindelser og organelle transfer i CHO (chinese hamster ovary) celler, der forskellige Cadheriner førte til endret antall nanorør og kontaktavhengig organelle transfer. Likeså var forholdene i epiteliale kreftcellelinjer og brystcellekreft modell-linjer, der organelletransfer korrelerer med endringer av Cadherin ekspresjon. Resultatene skal publiseres som «Role of E- and N-cadherin in the formation of TNTs and intercellular organelle transfer in the framework of EMT». Julia Schölermann, Tanja Kögel, Dominik Michael Frei, Katarzyna Wnuk-Lipinska, Ivan Rios-Mondragon, David R Micklem, Carien Niessen, and Hans-Hermann Gerdes. (Manuscript in preparation). 3)Nanorør er nå blitt den strukturen som en tror er mest aktiv for kontaktavhengig organelletransfer i ikke-immun celler og antagelig foregår det meste av denne transporten, og muligens alt, gjennom nanorør. For å oppnå raskere fremdrift valgte vi å utvikle en metode som undersøker kun kontaktavhengig organelletransfer på en mer effektiv måte, uten å analysere nanorør direkte. Med ny kunnskap kan man så gå tilbake og teste hypotesen om koblingen mellom nanorørene og kontaktavhengig organelletransfer. Vi fant en svært spesifikk og rask metode for kontaktavhengig intercellulær transfer. Transfer som foregår som fri diffusjon gjennom kulturmedium utgjør kun en minimal del av signalet i vår metode. Vi kan utelukke overføring fra avdøde celler, vi kan differensiere mellom signaler på innsiden og på utsiden av celler, vi kjenner den individuelle donorcellen, og vi kan observere cellemorfologi, ekspressionsmengder, cellekonstellasjoner og forskjellige parametere av det overførte materiale som tetthet, fordeling, størrelse. Ved hjelp av denne metoden, undersøkte vi effekten av 36 forskjellige siRNAer i en pilot screening. Vi identifiserte 16 små GTPaser og motorproteiner som spiller en rolle i kontakt-avhengig transport av organeller. Ved ekspresjon av fluorescens-markerte proteiner bekreftet vi noen av våre funn, og observerte egentransfer av noen av proteinene. Til sammen peker våre resultater mot involvering av cellulære protusjoner og tubulære resirkulerende endosomer i transfer prosessen. For å demonstrere relevansen av vår metode for kreftforskningen, hemmet vi transferen av proto-onkogenet H-Ras innen vår forsøksoppsett. Vi automatiserte opptak, mønster-gjenkjenning og bildeanalyse av vår mikroskopi-baserte screening metode for kontaktavhengig transfer mellom celler. Mønstergjenkjennings software «DonorFind» finner single donor celler i et mikroskopisk lav-oppløsende 2D opptak dom dekker hele celledyrkingsområdene av en 24-well plate. Så initierer «DonorFind» mikroskopet å kjøre tredimensjonale opptak av interessante regioner, styrt med hjelp av Leica «Matrix Screener». Disse blir segmentert med CellSegm (Hodneland E et al. Source Code Biol Med 2013). Transfer signal integrert over hver eneste celle med hjelp av "TransQuant". Denne kombinasjonen gjør det mulig å kjøre forsøkene i et statistisk meningsfull antall med høyere hastighet og mindre bias. ("Novel microscopy-based screening method reveals regulators of contact-dependent intercellular transfer." Dominik Michael Frei, Erlend Hodneland, Ivan Rios-Mondragon, Anne Burtey, Beate Neumann, Jutta Bulkescher, Julia Schölermann, Rainer Pepperkok, Hans-Hermann Gerdes and Tanja Kögel. (Manuscript in revision in Nature Scientific Reports). 4)Umodne, men ikke modne, hippokampale nevroner lager korte protusjoner mot astrocytter som blir til nanorør. Våre funn peker mot at nevroner i utvikling lager elektriske koblinger og veksler ut kalsium signaler med astrocytter som korrelerer med ekspresjon av connexin 43 (Wang X et al. PLoS One 2).

Tunnelling nanotubes (TNTs) were discovered only a few years ago as conduits for a previously unrecognised type of cell-to-cell communication. Since then, a growing number of cell types have been found to use TNTs to exchange diverse cargoes ranging from cytoplasmic signalling molecules such as calcium ions to small vesicles. In the past year, the human immunodeficiency virus, HIV, and prion proteins, the infectious agent that causes diseases such as scrapie in sheep and Creutzfeld-Jakob syndrome in human s, were found to spread between cells through these intercellular membrane channels. Due to the emerging wide range of implications of TNTs in the field of biological and biomedicial research, it is necessary to first learn the basic principles and mecha nisms of TNT-dependent cell-cell interactions by focusing on a few basic models. We here propose to focus on three main questions: First, in light of our data showing that filopodia are the precursors of TNTs, we will investigate how outgrowing filopodia evolve into TNT structures. Second, we will characterize/identify cell surface molecules as the likely candidates for establishing the contact/recognition of TNT precursors with the target cells. Third, we will identify the motor proteins facilitating the delivery of vesiclular cargo through TNTs. Detailed mechanistic insights into TNT-dependent cell-to-cell communication at the cellular level will allow to address the potential physiological implication of TNTs such as embryonic development, immune defen se and cancer. Furthermore, it will enable to develop molecular strategies to interfere e.g. with TNT-specific diseases including the spread of pathogens between cells.