Tilbake til søkeresultatene

FRIMEDBIO-Fri prosj.st. med.,helse,biol

Vital functions of distinct subcellular NAD pools

Tildelt: kr 3,5 mill.

NAD er et lite molekyl som er tilstede i alle celler. I mennesker blir det først og fremst dannet fra vitamin B3, også kalt niacin. NAD har to viktige cellulære funksjoner. For det første er det nødvendig for å omdanne den kjemiske energien i mat (som sukker og fett) til ATP, cellenes universale "energivaluta". I tillegg har NAD flere viktige regulatoriske funksjoner som kontrollerer viktige cellulære prosesser, deriblant reparasjon av DNA-skade, transkripsjon av gener og celledeling og differensiering. Ulike NAD-avhengige bioenergetiske- og signaleringsreaksjoner er avgrenset til spesifikke subcellulære organeller. NAD blir degradert når det blukes i en signaliseringsprosess, og ny NAD må derfor kontinuerlig syntetiseres i en metabolsk prosess som kalles NAD biosyntesen. Det er nå klart at NAD biosyntesen, og reguleringen av den, er viktige element i sentrale biologiske prosesser. Vi har fastslått funksjonelle og strukturelle egenskaper, i tillegg til den subcellulære fordelingen, av enzymer involvert i NAD biosyntesen. Alle enzymene befinner seg i aksen kjernen-cytoplasma, bortsett fra et enzym som befinner seg i mitokondriene. Til tross for den cellulære lokaliseringen av enzymene involvert i biosyntese har vi nylig funnet at NAD finnes i membranbundne organeller som mitokondria, peroksisomer, og til og med i ER og Golgi-komplekset, mens NAD-konsentrasjonen i kjernen-cytoplasma er veldig lav. Oppdagelsen av denne uventede NAD-fordelingen gir opphav til viktige spørsmål som vi fokuserer på i dette prosjektet. Hvordan opprettholdes NAD-nivået i disse organellene når NAD-transport antas å være fraværende i menneskeceller? Har disse NAD-reservoarene spesifikke signaliserings- eller bioenergiske funksjoner? Kommuniserer de med hverandre? Fungerer de som en buffer for NAD i cytosol og cellekjerne? Vi har etablert unike molekylære verktøy for å detektere endringer i NAD-nivået i organeller. Videre vil nye metoder bli utviklet for å finne de spesifikke rollene til biosyntetiske enzymer i de individuelle NAD-reservoarene og signalveiene. Nylig ble det oppdaget at NMNAT2 (et enzym involvert i NAD biosyntese) har en nøkkelrolle i aksonal overlevelse. Våre strukturelle analyser forklarer transporten av NMNAT2 til distale deler av aksonet. Vi vil derfor spesifikt utforske rollen til NAD-dannelse i aksoner. Vi har etablert flere samarbeid med anerkjente eksperter i flere felt for å sammen kunne benytte oss av det brede metodologiske spekteret som er nødvendig for gjennomføre dette utfordrende prosjektet på en vellykket måte. Vi har i denne prosjektperioden fokusert på å utforske NMNAT2 i en modell-cellelinje (PC12). Ved NGF behandling endrer fenotypen til PC12 cellene seg dramatisk, og de tilegner seg egenskaper som er karakteristisk for sympatiske nevroner. Vi har etablert PC12 cellekulturer som reagerer på NGF-behandling, og gjennomgår fenotypiske forandringer som ligner differensiering og dannelse av nevritter. Overraskende nok oppdaget vi at overuttrykkelse av NMNAT2 i PC12 celler reduserer cellenes evne til å danne lamellipodier, nevritt-lignende utløpere, ved NGF-behandling. Disse observasjonene peker mot en viktig rolle for NMNAT2 i formasjonen av nevritter. I tillegg har vi etablert et eksperimentelt system som åpner for analysen av intracellulært NADH nivå, en viktig pekepinn for energitilstanden til cellene. Metoden utnytter et syntetisk fluoriserende NADH-bindende protein. Når proteinet uttrykkes i cellene kan fluorescensmikroskopering brukes for å vurdere intracellulært NADH-nivå. Vi har, ved bruk av dette nye verktøyet, oppdaget at overuttrykk av NMNAT2 i PC12 celler fører til en reduksjon i NADH-nivå. Disse resultatene viser til en potensiell mekansime der det NAD biosyntetiske enzymet NMNAT2 kan påvirke PC12 cellenes evne til å reagere på NGF-behandling.

Degradation of NAD, a vital redox carrier, is a key element of fundamental signaling pathways. Both bioenergetic and signaling functions of NAD are compartmentalized. We have established structural properties and the subcellular distribution of NAD biosyn thetic enzymes. All enzymes localize to the nucleo-cytoplasm, except for one in mitochondria. Accordingly, we found NAD sequestered in membrane-enclosed compartments such as mitochondria, peroxisomes, but also in the ER and the Golgi complex, whereas the NAD concentration in the nucleo-cytoplasm is very low. This unexpected NAD distribution poses important questions which we will address in this project. How is NAD maintained in these compartments, even though NAD transport is absent from human cells? Do these pools have specific bioenergetic or signaling functions? Do they communicate with each other? Do they serve as buffer for cytosolic or nuclear NAD? We have established unique molecular tools to detect changes of organellar NAD contents. New methods will be developed to determine specific roles of biosynthetic enzymes for individual NAD pools and signaling pathways. Recently, a key role of NMNAT2 (an NAD biosynthetic enzyme) in axonal survival was revealed. Our structural analyses explain its transpo rt to distal parts of the axon. We will therefore specifically explore the role of NAD generation in axons. Several collaborations with recognized experts, for example, in the neurosciences, will consolidate the broad methodological spectrum required to s uccessfully conduct this challenging project. Our most recent results have established new tools that strengthen the feasibility of our approaches. Since NAD-mediated signaling regulates fundamental processes (including life span, the circadian clock, gen e expression, DNA repair, key metabolic pathways and apoptosis) the results of this project will contribute to important research fields and have an impact on new strategies for medical applications.

Budsjettformål:

FRIMEDBIO-Fri prosj.st. med.,helse,biol

Finansieringskilder