Innovative enzyme technology for biomass processing

Prosjektet gikk ut på å studere en hel ny type enzymer som ble oppdaget ved NMBU i 2010 (se http://www.umb.no/forsiden/artikkel/nytt-enzym-gir-berekraftig-biodrivstoff). Disse enzymer kalles i dag "LPMO" for "Lytic Polysaccharide Monoxygenase" og gjør enzymatisk nedbryting av biomasse, slik som cellulose, mye mer effektiv. Det finnes veldig mange slike enzymer i naturen, men kun få har blitt godt karakterisert. Oppdagelsen av LPMOs har revolusjonert feltet og allerede i dag finnes disse enzymer i en rekke kommersielle enzympreparater for bioraffinering. Prosjektets overordnede mål var å karakterisere en rekke slike LPMOs for å kartlegge hvilke aktiviteter de har og de grunnleggende mekanismene bak disse aktiviteter, samt å teste mulige anvendelser i bioraffinering av forskjellige typer biomasser. Et viktig spørsmål var om noen LPMOs kan virke på andre biomassetyper ("substrater") enn kitin og cellulose, som ved prosjektets start var de eneste to kjente substrater. I prosjektet har vi produsert og karakterisert flere nye LPMOs og dette har ført til nye innsikter i hvordan LPMOs virker og, ikke minst, til oppdagelse av LPMOs som virker på hemicellulose (xyloglukan, glukomannan). Dette siste, meget viktige funnet ble publisert i det prestisjetunge tidskrift PNAS, i 2014. Vi har brukt en rekke avanserte teknikker, slik som krystallografi, for bestemmelse av struktur, Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spektroskopi for å forstå enzymenes katalytiske mekanisme, mikroskopi for å forstå hvordan enzymene bryter opp substratet, og sete-rette mutagenese for å kartlegge aminosyrer som påvirker aktivitet, stabilitet og substrat spesifisitet. Resultatet av en slik "dybdekarakterisering" av det hemicellulose-aktive enzymet ble publisert i en massiv og banebrytende 15-siders artikkel i 2015. LPMOs bruker elektroner, og fra våre anvendte prosjekter har i 2014-2015 lært at tilgang til elektroner er et viktig suksesskriterie i industrielle bioraffineringsprosesser. Derfor har vi i prosjektets siste fase, i samarbeid med grupper i København og Wien, sett på hvordan enzymene får tak i disse elektronene mens de virker i sine naturlige omgivelser, f eks når en sopp bryter ned trevirke. Dette har ført til viktige nye innsikter, også på den anvendte side (altså: hvordan kan disse enzymene best utnyttes i en bioraffineri). Dette arbeidet har bidratt til to publikasjoner i toppjournalene Science og PNAS, begge våren 2016. De LPMOs som vi har studert i dette prosjektet blir testet ut i mer anvendte prosjekter i forskningsgruppen som er rettet mot effektivt enzymatisk bearbeiding av biomasse. Her tyder dataene på at LPMOenes effektivitet varierer veldig mellom substrater. Altså, visse LPMOer passer best for visse substrater. Dette innsiktet har selvfølgelig stor betydning for anvendelse av disse enzymer. Et av de siste resultatene fra dette prosjektet går ut på at det kan virke som om noen LPMOs er optimalisert for å virke på "kompositter", dvs blandinger av forskjellige polysakkarider, slik som man finner dem i planters cellevegger. Dette ser vi nærmere på framover, i nye prosjekter, fordi dette har både stor vitenskapelig og stor industriell interesse.

For many years, the enzymatic depolymerization of polysaccharides in plant biomass was thought to be accomplished by the complementary action of endo- and exo-acting hydrolases. Recently, however, it has been shown that there are additional enzymes, class ified as "CBM33" and "GH61", that aid in this conversion process using a hitherto unknown mechanism involving hydrolysis and oxidation. Genes encoding GH61 proteins are abundant in the genomes of biomass-degrading fungi and these enzymes are likely to act on a variety of biomass types. These recently discovered GH61 enzymes deserve massive attention since there are indications that they may be exploited to dramatically increase the efficiency of enzymatic biomass conversion. However, this enzyme class has hardly been explored and many crucial questions remain unanswered. In this project we will address such crucial questions by carrying out the following studies: (1) Cloning and expression of all or as many as possible GH61 enzymes from two biomass degrad ing fungi, Phanerochaete chrysosporium (17 genes) and Heterobasidion irregulare (10 genes). (2) Characterization of enzymatic activities, substrate-specificities and synergies with other enzymes (such as cellulases or other GH61s). (3) In-depth analysis o f the catalytic mechanism using atomic force microscopy to study enzyme-substrate interactions and using a variety of biochemical and biophysical techniques to unravel atomic details of the catalytic cycle; (4) Deepen understanding of GH61 functionality b y classical structure-function work (i.e determining crystal structures and testing effects of site-directed mutations); (5) Testing the applicability of GH61 for biomass conversion and designing optimal enzyme cocktails. The project will be based on the applicants' current leading position in research on these novel enzymes, including advanced analytical competence that is both unique and essential. There will be collaborations with groups in Sweden and Japan.