Molecular-based technical adaptation using oil-degrading bacteria for autonomous leakage detection

Dette prosjektet handler om å anvende miljøplattformen Environmental Sampling Processor (ESP, utviklet i MBARI), for sanntidsdeteksjon og analyse av vannprøver basert på genteknologi. ESP anvendes for miljøovervåking av petroleumsaktiviteter offshore med spesielt fokus på oljeutslipp i nordområdene. Vi har testet om ESP kan brukes til å detektere spesifikke genetiske markører i bakterier som blomstrer opp når det er olje i vannet . Råolje endrer artssammensetningen av bakterier i vannet: kort tid etter at olje lekker ut i vannet domineres bakteriesamfunnet av oljenedbrytende bakterier I dette prosjektet ønsker vi å bruke genetiske markører fra oljenedbrytende bakterier som biosensor for oljesøl - og ESP som teknologien som muliggjør sanntidsdeteksjon. Viktige milepæler i prosjektet var: identifisere relevante bakterielle markører for oljeforurensning, deteksjon av disse markørene med analytiske lab protokoller brukt av ESP og validering med ESP. 1) Først ble utvalgte bakterier testet mot relativt høye oljekonsentrasjoner (0.1%) i kaldt vann (4?C). Bakteriene ble valgt ut på grunn av deres kjente rolle i oljenedbrytning. Viktige bakterielle familiegrupper ble funnet å være Gammaproteobacteria (spesielt Oceanospirallaceae), Alphaproteobacteria og Flavobacteria. (WP1). 2) I neste fase utførte vi forsøk med en realistisk oljegradient og flere analyser ved å bruke protokoller som ESP bruker i dag. Oljekonsentrasjoner mellom 30 ppb og 2000 ppb ble testet i forsøket. Q-PCR ble anvendt for å analysere og kvantifisere antall mikrobielle gener Det var en god korrelasjon mellom antall gener for spesifikke bakterier og mengden med olje blant annet for Alcanivorax sp., Cycloclastius sp., Oleispira antarctica, Marinomonas sp. og Thalassolituus oleivorans. Andre bakterier som Colwellia sp., økte i antall uavhengig av oljemengden. Forsøkene ble utført i vårt laboratorium utenfor Stavanger, med vann fra Byfjorden som er pumpet fra 80 m dyp (WP2). 3) I en feltstudie utført våren og vinteren 2014 på Grønland, gjorde vi et tilsvarende forsøk med vann samlet under isen for å se om resultatene fra forsøket med Byfjord-vann samsvarte med resultater fra reelt arktisk vann fra Grønland. Q-PCR analyser bekreftet det vi fant i forsøket med vann fra Byfjorden: Oleispira antarctica og Colwellia er de to bakteriene som egner seg spesielt bra som oljemarkører i kaldt vann . Det virker dermed som at disse to artene er robuste biosensorer for olje i Arktisk vann. Det var allikevel forskjell i respons mellom dem; økningen av antall Colwellia viste seg å være like stor i forurenset vann både vinter og vår i feltforsøket fra Grønland, mens Oleispira ble detektert senere ved kald vinter temperatur enn om våren. Andre feltprøver analysert med tilsvarende metoder (e.g. Full City cargo ship, Langesund, Norway) viste samme trend med Oleispira antarctica, Alcanivorax sp., Cycloclasticus sp. og bakterier som hører til Colwelliaceae som viktige oljemarkører (WP3). 4) To ESP instrumenter ble transportert til IRIS for å teste qPCR og SHA (Sandwich Hybridization Assay) protokoller optimalisert for olje deteksjon i løpet av prosjektet. ESP ble brukt til å analysere forurenset vann i et oppsett med olje. En av de to instrumentene var brukt for å analysere kun rent vann for å sammenligne med forurenset vann. Olje konsentrasjonen i vannet som ble analysert av ESP variert fra 1.9 mg/l (start) til 0.5 mg/l og 56 ?g/l (start) til 4.5 mg/l sum PAH. Oleispira ga de beste resultatene for qPCR og deteksjon av forurenset vann i studiet etter 3 til 4 dager. Colwellia økte men visste ingen forskjell i kontroll og olje eksponert tankene. Når det gjelder SHA testen, var responsen i vannprøvemateriale eksponert for olje for svak sammenlignet med kontrollen og ingen signifikant forskjell sett mellom kontroll og olje tankene. En utfordring var en kunstig høy bakgrunn av mikrobe biomas i kontroll tankene som følger «lab effekter» som forstyrte SHA. I oppsummering, ESP q-PCR protokoller optimalisert for deteksjon av olje nedbrytende mikrober som følger av oljespill i vannet egner seg til deteksjon av olje i vann. Mikrober som hører til Oleispira er best for rå olje deteksjon men deteksjon skjer etter noen dager. SHA må optimaliseres videre.

Oil and Gas (O&G) industries are moving towards deeper and colder areas requiring new technologies capable of real-time monitoring, and rapid access to operational and environmental information. Regarding subsurface oil leak detection, the Environmental S ampling Processor (ESP) developed by researchers of MBARI (Monterey Bay Aquarium Research Institute) is bearing great potential for underwater sensing related to O&G installations. The ESP is a field-deployable device designed to collect water samples and apply autonomously molecular assay technologies to identify specific marine targets used as markers of water conditions. The objectives of this application are 1) to demonstrate that molecular assays that use oil-degrading microbial targets are suitable for oil leak detection and 2) adapt the ESP device accordingly and validate the performance of this device for near-real time oil leak detection in field-simulated deployment in the laboratory. Three work packages (WP) and several milestones (M) are plann ed: In WP1, we will select oil-degrading microbial species and design the corresponding molecular probes specific to the target species and genes involved in the degradation of petroleum compounds (M1). In WP2, we will proceed with developing the detectio n assays in a fashion that is compatible with the ESP device and in situ operations (M2). After testing the new assays using conventional laboratory equipment, MBARI will assist with testing those assays on the ESP itself (M3). If results of these prelimi nary trials are encouraging, MBARI will bring an ESP to IRIS facility for final laboratory testing using relevant oil leakage scenarios for North Sea and sub-Arctic conditions, and further to explore how the instrument will be deployed in Norwegian waters (M4). This work is in step with MBARIs vision for ESP development within the time frame of this project: deployment of ESP on autonomous underwater vehicles (AUV) for mobile deployment at O&G installations.