Developing methods for study of redox proteins by combining synchrotron radiation (e.g. crystallography) and single-crystal spectroscopy

Forskningen i Metalloproteingruppen på IBV Seksjon for Biokjemi og Molekylærbiologi (BMB) (med Raman instrument på KI og elektronparamagnetisk resonans (EPR) instrument på FI) ved UiO og ansatte ved Svetsisk-norske strålelinjen (SNBL; BM1 ved ESFR, Grenoble) har gjennom de senere årene ledet an i utviklingen og bruken av in-situ enkrystall spektroskopiske metoder i kombinasjon med proteinkrystallografi på synkrotroner. Det nåværende prosjektet fokuserer på å videreutvikle disse metodene, og å bruke de til å løse biologisk viktige spørsmål. En postdoktor Dr. Røhr var 6 måneder i Grenoble og styrket instrumentoppsettet på SNBL for ytterligere å utvikle bruken av kombinerte enkrystallspektroskopi og proteinkrystallografi. Han utviklet et semi-automatisk oppsett på den nye detektoren Pilatus. Røntgenkrystallografi er en metode for å bestemme proteinstrukturer, men kan ikke gi informasjon om protonering, oksidasjonstilstand eller spintilstand. For metall- og redoksproteiner er disse egenskapene viktige for å forstå deres struktur og funksjon. I løpet av det siste tiåret har det sakte blitt mer fokus Røntgenstrålingindusert reduksjon av disse enzymer. Vi fokuserer på enzymer som er involvert i aktiveringen oksygen og elektrontransport, som er av de viktigste prosessene i livet. For å forstå prosessene som respirasjon og fotosyntese, er det viktig å forstå elektrontransport innenfor og mellom disse systemene. Aktivering av oksygen anvendes i en rekke reaksjoner, f.eks. av kompleks IV i celleåndingen som produsere en protongradient til ATP-syntesen, av cytokrom P450 til å oksidere og metabolittisere en stor gruppe av naturlige substanser og legemidler, og av ribonukleotidreduktase klasse I i syntesen av deoksyribonukleotider. Alle disse redoksproteinsystemene bruker metallkofaktorer for å utføre sin funksjon, noen av dem har tyrosyl-, tryptonyl- og thiyl-radikaler. Prosjektet fokuserer på protein-protein interaksjons og proteinkomplekser. Prosjektet hadde én postdoktor ansatt fra 1 august 2012 og totalt 24 månader. Denne postdoktor presenterte en poster allerede i juli 2012 og et annen gruppemedlem hadde en foredrag på den internasjonale konferansen i feltet ?Simultaneous Combination of Spectroscopies with X-ray Absorption, Scattering and Diffraction Technique? i Zürich (CH). Prosjektet har hatt flere publikasjoner med høy gjennomslagskraft. Gruppen var en del av en publisering i fremragende tidsskriftet Nature, hvor krystallstrukturen av medisinsk relevant haptoglobin-hemoglobin komplekset ble publisert. Vi har bidratt med vår kompetanse innen UV-vis og Raman-spektroskopi på protein enkrystall som viser at komplekset var i sin oksygenerte tilstand i komplekset. Vi har en stor ribonukleotidreduktase review i Coordination Chemistry Reviews med impact factor (IF) over 11 og vårt protein kompleks mellomribonukleotidreduktase R2F/ NrdF og NrdI fra Bacillus cereus ble publisert i ACS Chem. Biol. Flere studier ble publisert i tidsskrift med IF over 3 for mus, human, karuss, Mycobacterium tuberkulose og Bacillus cereus ribonukleotidreduktaser R2 / p53R2 / R2F / NrdF proteiner studert med elektron paramagnetisk resonans og Raman, samt i samarbeid med Stanford University og CNRS i Frankrike. Videre ble en oppfølgings EPR studie publisert med IF på tre på et kobber protein med 3D-struktur som var tidligere løst ved Universitetet i Tromsø i samarbeid med Universitetet i Bergen og NTNU, som viste tilstedeværelse av Cu (II) og 2 forskjellige Cu (II) seter i utskilt protein (MopE *) fra metanoksidere Methylococcus capsulatus bakterien (Bath). Vi har publisert studier av aktivering av tyrosin mono-oxygenase. Vi har studert kopper proteiner i bl.a. PNAS USA og Biochemistry av kitin-aktive and cellulose-aktive AA10-type lytic polysaccharide-monooxygenases. Vi publiserte den første strukturen av Bacillus cereus NrdH (tioredoksin BC3987) og foreslo en annerledes reaksjonsmekanisme i et tidsskrift med IF over 3. Sammen med Univ. of Rochester har vi kunnet vise med røntgendiffraksjon og microspektrometri i et tidsskrift med IF 3,74 at en annen retning på heme Fe (III) koordinert metionin forklarer dens dynamikk. Vi tok del i et prosjekt der en mutant viktig for sent oppståtte methylmalonic acidemia og homocystinuria ble karakterisert. I Chemical Communation IF 6,8 vi publiserte bevis på at i KatG heme tilgang er viktig. Gruppeleder har holdt foredrag i Kina 2013 og Taiwan 2014 og på ZING og COST konferanser. Dr. Hans-Petter Hersleth har gjort viktige presentasjoner. Vi har vært aktive på flere internasjonale møter f.eks. International Konferanse om Biologisk Uorganisk Kjemi i Grenoble og International Union of Crystallography in Montreal og nasjonale møter.

The aim is to further develop methods to be able to understand functional aspects of redox protein systems. X-ray protein crystallography (PX) determines the protein structures, but cannot give information of protonation, oxidation or spin state. For redo x proteins these properties are vital for understanding their structure and function. To be able to be in a position to answer some of the fundamental questions regarding the function of these proteins, a scheme combining several biophysical methods is es sential, especially the combination of PX and in-situ single-crystal UV-Vis and Raman spectroscopy is a very beneficial and emerging approach. During the last decade more and more focus has been put on the X-ray radiation-induced reduction of redox prote ins. Most probably are many of the structures published in the PDB not in the oxidation state that the authors originally stated. Therefore some of the challenges in this field are to have good spectroscopy setups at synchrotron beam lines for PX, so care can be taken in monitoring radiation damage, and trying to avoid it. Therefore a focus will be on understanding and develop approaches to tackle the radiation damage of redox proteins. The biological research interest will be on the functional understan ding of a few protein systems involved in oxygen activation and electron transport: the ribonucleotide reductase protein system and on the haem protein systems of NO-synthase, catalase-peroxidase, cytochrome c and myoglobin. Key challenges involving these protein systems are to both understand the systems on an electronic level for elucidating the detailed reaction mechanism, as well as the interaction between the different proteins.