Tilbake til søkeresultatene

GLOBVAC-Global helse- og vaksin.forskn

Genetically engineered N. lactamica as a vaccine delivery agent

Tildelt: kr 7,0 mill.

Prosjektnummer:

220901

Søknadstype:

Prosjektperiode:

2013 - 2020

Geografi:

Samarbeidsland:

Neisseria meningitidis (Nm) er en bakterie i normal halsflora som kan spre seg i kroppen og forårsake alvorlig blodforgiftning og hjernehinnebetennelse, spesielt hos små barn og tenåringer. Selv om vaksiner er underveis, oppstår det stadig nye farlige Nm-varianter. Det er derfor et stort behov for flere nye vaksiner. Neisseria lactamica (Nla) er en helt ufarlig nær slektning av Nm, som også oppholder seg i halsslimhinnen. Nla bærerskap i halsen er mest vanlig hos barn opp til 15 år. Personer som bærer Nla utvikler immunitet mot Nla samt antistoffer som kryss-reagerer og kan gi beskyttelse mot den farlige Nm. En genetisk manipulerbar Nla som kan uttrykke en optimal profil av Nm- eller andre antigener, relevant for vaksineformål, er derfor en meget attraktiv modell. Imidlertid er Nla, i motsetning til Nm, svært motstandsdyktig mot genetisk manipulasjon. Dette er den store hindringen for å bruke Nla som en ufarlig bærer av vaksineantigener. Mens Nm hele tiden kan ta opp DNA ved transformasjon, er Nla mye mer restriktiv mot opptak og integrering av DNA. Derfor har vi forsket for å oppdage årsaken til denne barrieren, slik at vi nå er i stand til å genetisk manipulere Nla-stammer. Vi har derved oppnådd hovedmålet med VACLAC-prosjektet, som er å benytte Neisseria lactamica (Nla) som en naturlig vaksinekandidat mot meningokokker og i tillegg genetisk modifisere Nla for å øke dens vaksinepotensiale. 1. Neisseria lactamica revers genetikk for å lage nye vaksinestammer: Først etterlyste vi i alle Nla genomsekvenser gener som koder for såkalte restriksjons-modifikasjonssystemer (RM) som kutter opp fremmet DNA. Vi oppdaget også en 4-nukleotid-sekvens i DNA, CATG, som ble signifikant unngått i alle Nla-genomene, sammenlignet med Nm. NlaIII er Nla restriksjonsenzymet som gjenkjenner CATG og som bare finnes hos Nla, men ikke hos Nm. Vi foreslo at NlaIII-mediert restriksjon er hovedbarrieren mot genoverføring hos Nla. For å teste denne hypotesen, syntetiserte vi et modifisert Nla DNA som manglet alle Nla RM gjenkjennelsesmotiver og brukte dette for å slå ut genet som koder for NlaIII. Derved kunne vi transformere en selektiv markør inn i Nla-genomet, noe som tidligere var umulig. 2. Konstruksjon av Nla-stammer som uttrykker Nm-antigener: Ved hjelp av NlaIII-mutanten utviklet vi en ny måte for å manipulere Nla genetisk og lage nye stammer. Disse kunne brukes til å uttrykke spesifikke vaksineantigener. De nye Nla-stammene testet vi videre. For å kunne velge aktuelle potensielle vaksineantigener, utforsket vi først protein/antigen-profilen hos Nla og Nm. Vi analyserte Neisseria-celler ved sensitiv massespektrometri (MS) for å bestemme hele neisseria-proteomet. Derved identifiserte vi > 2100 proteiner fra Nla og Nm. Proteinene som ble uttrykt forskjellig i Nla og Nm var hovedsaklig sekresjonskomponenter og karbohydrat metabolisme-enzymer (mye i Nla) og jernregulering (mindre i Nla). Det er verdt å merke at det var konservert uttrykk av flere overflatekomponenter som er potensielle vaksine-kandidater. Derved ble tilnærmet hele Nla-proteomet sammenlignet med Nm, som en basis for å velge potensielle vaksinekandidater til de nye Nla-stammen. 3. Det immunogene potensialet av Nla-vesikler: Deretter renset vi yttermembranvesikler (OMV) fra Nla og Nm. OMVer er viktige vaksinekandidater. I OMV fra både Nla og Nm var det store mengder overflate-eksponerte vaksinekandidater som PilQ, FetA, og Opa, mens i Nla OMV var det økt mengde autotransportere og et sekresjonssystem. Vi definerte Nla immunogenisitet ved å bestemme deres evne til å stimulere produksjon av beskyttende antistoffer i blod. Vi etablerte en musemodell for å teste effekten av den nye Nla-stammen i vaksinesammenheng. Nla- eller Nm- OMV ble sprayet på slimhinnen i halsen eller injisert inn i spinalvæsken som omslutter hjernen. Reaksjonene på dette ble målt. Analyser av hva som skjer i bakteriene og i vertscellene etter vaksinasjon ble utført. Det viste seg at både Nla og Nm OMV i halsslimhinnen var beskyttende. Vi testet også Nla-konstruktene videre i immunoscreens med pasientsera. 4. 3D struktur-karakterisering og screening av Nla vaksineantigener 3D struktur-karakterisering av of Nla PilQ, FetA, DprA and Opa ble utført. Ved bruk av 3D cryoEM og NMR ble den overflate-eksponerte delen Nla PilQ-multimeren, som inneholder beskyttende antigener, karakterisert. For å definere det immunogene potensiale til Nla OMV membranproteiner, laget vi en chip med Nla antigener og testet reaktiviteten av pasient-sera, som viste overflate-eksponerte deler av PilQ. 5. Nla protein glykosylering via revers genetikk og immunosøk Glykosylering av Neisseria-proteiner er viktig for celleadheranse. Ved MS oppdaget vi Nla protein glykosylering og den tilsvarende oligosakkaridstrukturen. Nye mutanter analyseres nå for å definere betydningen dette har for protein-antigenisitet. VACLAC-prosjektet peker derved mot nye former for forebyggelse av hjernehinnebetennelse og andre infeksjoner.

The LACVAC project addresses meningococcal disease which is a major public health burden worldwide, particularly striking small children and teenagers. Virulent isolates of the causative agent, Neisseria meningitidis (the meningococcus, Mc), are covered b y an antiphagocytic capsule. Capsule-based vaccines are available for most Mc strains, but cannot be used for those belonging to serogroup B. The hyperdynamic Mc genome also gives rise to new variants and new serogroups are emerging. The need for new and better vaccines against Mc, including MenA, MenB and MenW, is therefore compelling. Moreover, antigen delivery at mucosal sites has been a major goal in preventing disease many important human infectious diseases. Mucosal immunization can induce both humo ral and cell-mediated protection, at the mucosa as well as systemically. In these contexts, the closely related but non-pathogenic species N. lactamica (Nla) is attractive and promising as a human mucosal vaccine delivery vector. We will genetically modif y the natural Nla candidate to enhance its vaccine potential when delivered intranasally in humans. We will also characterize and test already identified Mc vaccine candidates in Mc and Nla outer membrane vesicles (OMVs), where targeting complex membrane proteins represents a new approach to the search for components with vaccine antigenic potential. The strategy proposed builds on the seminal and complementary findings by our consortium in this field, ranging from basic genetics and antigen discovery to vaccine delivery in a translational approach, highly relevant for capacity building in Norway and LMIC countries and the current GLOBVAC call. Furthermore, the strategy proposed also represents a model system for combating multidrug-resistant gonorrhea an d a multitude of other infectious diseases worldwide.

Publikasjoner hentet fra Cristin

Ingen publikasjoner funnet

Ingen publikasjoner funnet

Budsjettformål:

GLOBVAC-Global helse- og vaksin.forskn