The mucosal surfaces of the Atlantic salmon: A site for viral entry and possible passive immunization.

I fiskeoppdrettsnæringen utgjør smittsomme sykdommer et stort økonomisk og dyrevelferdsmessig problem. For å møte disse problemene har resistente fiskelinjer blitt utviklet mot enkelte sykdommer og vaksiner gitt ved injeksjon benyttes i dag på størstedelen av all oppdrettsfisk. Slike vaksiner har vist seg å være effektive mot bakterielle sykdommer, men er dessverre ikke like vellykket mot virussykdommer. Injeksjonsvaksinering av hver eneste fisk er ikke bare dyrt for oppdretterne, men skaper også et stort stress på fisken. I tillegg er ikke slik vaksinering gjennomførbart på små fisk eller etter sjø-utsetting. Utvikling av alternative terapeutiske metoder mot infeksjonssykdommer er derfor fordelaktig. I dette prosjektet ønsket vi å se nærmere på muligheten for passiv immunisering av fisk som en alternativ terapeutisk metode. Passiv immunisering kan utføres på fisk ved å tilsette fôret antistoffer fra et annet dyr mot et spesifikt smittestoff for da å kunne redusere omfanget av en infeksjon. Dette kan skje ved at antistoffene blokkerer smittestoffet og dermed hindrer enten opptak fra tarmen eller videre binding til immunceller slik at immunreaksjonen reduseres. Smittestoffet vi anvendte som modell var IPN-virus som forårsaker infeksiøs pankreas nekrose (IPN), en viktig sykdom innen laksenæringen. Vi ønsket å benytte enkelt-domene antistoffer (sdAb) fra lama ettersom disse har vist seg å være effektive i nøytralisering av virus og med stort terapeutisk potensiale. Disse antistoffene har en ulik profil fra konvensjonelle antistoffer i at de kun består av tung-kjeder, mens mangler lett-kjedene. De er små i størrelse hvilket bidrar til at de lettere har tilgang til epitoper i kløfter i de foldede proteinene som er utilgjengelige for de større klassiske antistoffene. At lett-kjedene mangler gjør de dessuten mer stabile for forandringer i miljøet og de skal tåle store forandringer i temperatur og pH. Dette gjør de enkle å manipulere genetisk og de kan lett produseres i store kvantum som rekombinante proteiner for terapeutiske formål. Prosjektet kan deles inn i to delmål. Den første delen inkluderte immunisering, identifisering av spesifikke antistoffer, sekvensering og optimalisering av rekombinant proteinproduksjon. Den andre delen besto i å teste antistoffene under ulike forhold samt testing av nøytralisasjonsegenskaper. Produksjon av antistoffer med høy affinitet mot IPNV gikk dessverre ikke som planlagt, men vi oppnådde til slutt svak binding til IPNV med ELISA ved å koble på en ekstra proteinhale til antistoffene. Antistoff-stabilitet i tarmens miljø, som magesyre og slim, ble derfor testes ved bruk av et allerede karakterisert antistoff (GFP-sdAb) med verifiserte bindingsegenskaper for målproteinet (GFP) produsert på tilsvarende måte i bakterie. Også til opptaksstudier via tarmepitelet ble dette antistoffet (anti-GFP) benyttet. Vi ser fortsatt på passiv immunisering som en så potensielt lovende strategi at slike grunnleggende studier vil være av stor faglig nytte. Som del av prosjektet ble en review-artikkel publisert i 2017 i det høyt rankede tidsskriftet Journal of Immunology, med tittelen «Passive Immunization of Farmed Fish» om potensialet til passiv immunisering i akvakultur. Et manuskript om stabiliteten av lama sdAb er også under utarbeidelse og vil bli submittert til et internasjonalt vitenskapelig tidsskrift innen utgangen av 2017. Videre håper vi at resultatene fra konstruksjonen av ulike rekombinante sdAbs og de anvendte modifiseringsstrategier av proteinuttrykket kan føre til en vitenskapelig publikasjon i fremtiden.

By generating knowledge on infection routes across the mucosal surfaces and by examine alternative therapeutic strategies to prevent and reduce the risk of disease outbreaks, this application meets the priorities in the call set by the Norwegian Research Council, (HAVBRUK, Tema 2 - Frisk Fisk). Infectious disease poses a serious threat to the productivity of the aquaculture industry. Disease resistant fish strains and vaccines are valuable tools to fight diseases, but knowledge on additional therapeutic s trategies will in the future be essential to hold back present and emerging diseases and keeping a healthy and sustainable industry. With this in mind, the current project will provide fundamental insight into uptake across the mucosal surface and the pot ential of passive immunization in salmonids. To examine this possibility, specialized recombinant antibodies will be developed toward infectious pancreatic necrosis virus. The antibodies will be tested for their virus neutralizing abilities in Atlantic sa lmon, but also used as a model to examine the potential of such passive immunization in general. Passive immunization of salmon can be administrated where and when there is a high risk of infection. Such immunization systems may be very helpful, particul arly during the seawater growth stages in which vaccination through injection is not possible. Passive immunization will not, by it self, give humoral immunity, but could potentially block infection or reduce the severity of disease to give the fish suffi cient time to develop its own immune response. If an outbreak is diagnosed, these antibodies targeted toward the pathogen may have the capability restrain transmission by reducing the shedding and uptake of the pathogen.