Inheritance of epigenetic patterns under the influence of diets and contaminants

Dette prosjektet ble etablert for å få dypere kunnskap om hvordan næringsstoffer og giftstoffer endrer epigenetisk DNA-metyleringsmønstre hos fisk. Prosjektet har vært delt inn i fire arbeidspakker (WP): WP1: I WP1 undersøkte vi hvordan arakidonsyre (ARA) i foreldrenes fôr påvirket avkommet (F1) gjennom epigenetiske endringer. Ved å bruke sebrafisk, fant vi ut at diettene forandret foreldres metabolisme, og påvirket genuttrykk og DNA-metylering i begge generasjoner. Hos foreldrene endret ikke fôret kroppsvekten, men endret den metabolske profilen av lipider. Sekvensering av barnas lever viste at avkommet ble påvirket både når det gjaldt DNA-metylering og genuttrykksprofiler. Effekten på genuttrykk var svakere hos foreldrene enn hos avkom. Genene med endret DNA metyleringsmønstre viste seg å være i de samme metabolske signalveier som var endret i foreldrenes metabolisme, noe som kan forklares ved at foreldrenes diett påvirker avkommet via epigenetisk programmering på tidlig livsstadier via DNA metylering av gametens DNA eller via næringsstoffinnholdet i plommemassen. Ph.d.-stipendiaten forsvarte avhandlingen og oppnådde doktorgrad i mars 2018. WP2: Fokuset her var rettet mot epigenetisk regulering via 1C næringsstoffene (folat, vitamin B12, vitamin B6, cholin og metionin). Vi brukte sebrafisk som modell og studerte kjønnsmoden F1 fra foreldre som hadde fått lite 1C i kosten. Avkommet hadde en blek rød lever som skyltes høyere nivå av lipid i levercellene. Videre viste RNA-sekvensering endringer i steroid- og mitokondrie signalveier. DNA-metylering viste seg å være svært følsom for foreldrenes 1C næringsnivå, spesielt for genenes promotorregioner. Av 2869 forskjellig metylerte CpG?er som var påvirket epigenetisk av foreldrenes 1C nivå, hadde genet ppp2r2ba sterk hypometylering i 20 CpG-steder i alle replikatene. Dette genet regulerer cellevekst og celledeling. Mutasjoner i dette genet har vært knyttet til ødeleggelser i sentralnervesystemet. Det er mulig at forskjellene i DNA-metylering ble etablert tidlig i utviklingen, og disse kan ha regulatoriske effekter i andre vev. Ved å bruke laks inkluderte vi tre forskjellige nivåer av 1C næringsstoffer, og genene i steroid signalveiene ble regulert spesifikt etter nivået i fôret. Fra de samme fiskene har vi fått renset DNA og metyleringsprofilen er sekvensert. Vi er nå i ferd med å analysere DNA-metyleringsmønsteret ved å tilpasse vår bioinformatiske metode til laksegenomet. WP3: Målet med WP3 var å identifisere forskjeller i DNA metyleringsmønsteret i spytt fra spebarn og korrelere det med mødrenes Hg-status og sjømattinntak, samt å studere effekten av MeHg og umettede fettsyrer i sebrafisk. Dessverre kom vi ikke i mål med første del av prosjektet pga. at DNA isolert fra spyttprøvene var delvis degradert. En studie med bruk av sebrafisk ble utført for å belyse transgenerasjonelle effekter av MeHg på DNA-metylering i F1 og F2-embryoer. WP4: Målet med WP4 var å bestemme mulige endringer av epigenetiske mønstre forårsaket av miljøgifter påvist i sjømat ved å bruke sebrafisk og laks som modell. Resultatene viser at både genuttrykksmønsteret og epigenomet hos fisk kan påvirkes av disse miljøgiftene. For sebrafisk har vi funnet at bisfenol A (BPA), som blant annet finnes i matembalasje, påvirker larvenes svømmeaktivitet og kan påvirke DNA metylering. Spesielt har vi observert at protocadheriner er epigenetisk sensitive for BPA eksponering. Protocadheriner er viktige for nervecellers vekst og differensiering. BPA eksponering påvirket videre fosfatidylinositol, VEGF og MAPK signalveier. I tillegg har vi testet flere andre giftstoffer som 1,2-bis(2,4,6-tribromofenoksy)etan (BTBPE), klorpyrifos (CPF) og tris(2,3-dibromopropyl) fosfat (TDBPP) for effekter på DNA metylering og genekspresjon i sebrafisk. Mens CPF påvirket hedgehog systemet og gener knyttet til oocytt-meiose, hadde TDBPP effekter på signalveier knyttet til kardiomyocytter. Oppfølgende studier har vist at noen av disse miljøgiftene påvirker mekanismer knyttet til DNA metylering også i leverceller fra laks. Sammen viser disse resultatene at epigenetisk regulering i fisk er svært følsom for både næringsstoffnivå og miljøgifter.

This project was established to gain deeper knowledge on how nutrients and contaminants alter the epigenetic DNA methylation pattern in fish. Together these results show that epigenetic regulation in fish is highly sensitive to both nutrient levels and toxicants, and have led the way towards new research areas on developmental programming in terms of either abiotic or biotic environmental changes. The results have gained new insight at the molecular level of epigenetic modification, both in terms of nutritional programming and metabolic programming (toxicants). We have shown that these environmental changes, when applied during early stages of development, permanently adjust the physiology in terms of gene expression and liver histology at later life stages. As such, the results have shed new light towards focus on broodstock nutrition and early environmental stressors for fish.

Epigenetics is the changes in phenotype due to processes arising independent of DNA sequence. This project will establish new knowledge on how nutrients and contaminants, alone or together, alter the epigenetic patterns in Atlantic cod, A. salmon and in h umans. Diets for aquacultured species are now based on plant ingredients. With plant proteins, it is likely that the one-carbon cycle is affected and possibly also the DNA methylation. Omega-6 levels increases with the use of plant oils and tilt the balan ce between omega-3 and -6 fatty acids. These are essential but have different effects on health and development. Therefore, zebrafish will be fed diets with either low levels of B-vitamins and methionine or with high levels of omega-6 fatty acids and be a model for the epigenetic changes driven by these nutrients. Based on this, analysis of samples from life cycle experiments (A. cod and A. salmon), running in other projects. A good nutritional status ameliorates several effects of contaminants, but the m echanisms behind is largely unknown. Epigenetics is likely to be one. A feeding trial with A. salmon juveniles will be done with diets spiked with methyl donors and co-factors in the one-carbon cycle (i.e. B5, B6 and B12). These will then be exposed to ne w and emerging toxicants (in feeds and feedstuffs for aquaculture, like pesticides) through their diet to elucidate how an optimal diet can produce a fish with higher resilience. The choice of contaminants will be based on a screen using zebrafish embryos /larvae exposed to a set of emerging toxicants (in accordance with considerations from EFSA). Seafood consumers get both methylmercury (MeHg) and omega-3 fatty acids (n-3PUFAs). n-3PUFAs have been shown to ameliorate the effects of contaminants. Data ob tained by analysing epigenetic patterns in human samples, correlated to the intake of seafood and the levels of MeHg, will be the basis for experimental studies using zebrafish focusing on neural development.