Resolving molecular mechanisms of biomass degrading enzymes through a combined computational and experimental approach

Cellulose og kitin består av lange kjeder med sukkermolekyler som er pakket tett sammen, noe som gjør at de er umulige å løse opp i vann. Mye av tilgjengelig biomasse i dag består av nettopp disse karbohydratene, og slikt sett er de potensielt verdifulle ressurser for bioraffinering, for eksempel produksjon av bioetanol. En stor utfordring når man jobber med cellulose og kitin er at disse stoffene er uløselige i vann. For ikke lenge siden ble det kjent at en ny klasse enzymer bidrar til å løse denne utfordringen. Disse enzymene går under navnet lytisk polysakkarid monooksygenase (LPMO) og produseres av en rekke bakterier og sopparter. LPMOer kan binde til overflaten av tettpakkede polysakkarider for så å bruke kobberioner og oksygen til å kutte sukkerkjedene. Slik dannes det en rekke løse sukkerkjedeender som andre enzymer griper tak i og deler opp i mindre biter. Imidlertid er ikke mekanismen for reaksjonen mellom enzym, kobber, oksygen-forbindelse og polysakkarid kjent. I dette prosjektet tar vi sikte på å finne ut av denne, og for å klare det vil vi kombinere både molekylmodellering og eksperimenter på laboratoriet. Vi har utført modellering av en kitin-aktiv LPMO på flere forskjellige kitin-typer ved hjelp av molekyldynamikk simuleringer og kvantekjemiske beregninger. Disse resultatene ble støttet av data fra EPR spektroskopi og biokjemiske analyser. I samarbeid med en annen forskningsgruppe hadde vi et stort gjennombrudd i 2017. Det viser seg nemlig at LPMOer er mye mer effektive når de bruker hydrogenperoksid, og ikke molekylært oksygen til å kløyve sukkerkjedene. Vi har også sett på protoneringstilstander av aminosyresidekjeder nær det aktive setet hos enzymet ved å bruke molekyldynamikksimuleringer. Disse resultatene er svært viktige når vi skal modellere selve reaksjonsmekanismen til LPMOene. I 2018 har vi tatt i bruk metoder som måler hvor fort LPMOer kan katalysere reaksjoner. Ved hjelp av disse metodene har vi kunnet dissekere reaksjonsmekanismen til enzymet, både ved å bruke eksperimenter og tunge kvantekjemiske beregninger. Resultatene hjelper oss til å forklare hvorfor LPMOer foretrekker hydrogenperoksid framfor molekylært oksygen, og har gitt oss innsikt i hvorfor LPMOer er sårbare for oksidativ skade. Samlet sett har vi kommet fram til gode modeller for reaksjonsmekanismen LPMOer bruker til å kløyve substrater. Ved å bruke rasjonelt enzymdesign, basert på datamodeller, kan vi i framtiden også endre funksjonaliteten til LPMOene, og prøve å gjøre de mer effektive/tilpaset bruk i industrielle prosesser.

Dette prosjektet har involvert og hatt virkning på en rekker personer; en stipediat, en forsker og flere nasjonale og internasjonale samarbeidspartnere. Personene som har vært involvert har delt informasjon og dette har økt til økt kompetanse hos alle involverte samt etablering av ny metodikk på NMBU. Effektene fra dette grunnforskningsprosjektet ventes å slå inn på fagfeltene biokatalyse og foredling av biomasse. Vi har bidratt til å forstå hvordan enzymer fungerer, og har derfor vært med å forme grunnlaget for industrielle anvendelser.

The highly abundant biomass feedstocks of the recalcitrant polysaccharides cellulose and chitin are valuable resources for current and future biorefining processes that have positive impacts on the environment and society. A major bottleneck of recalcitrant polysaccharide utilization is solubilization of the individual sugar chains, making them available for hydrolytic enzymes. The recently discovered enzymes named lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), are designed by Nature to solve this problem, cleaving polysaccharide chains packed in a crystalline form. LPMOs use molecular oxygen and copper to cleave cellulose and chitin. However, the oxygen activation mechanism and the overall reaction mechanism with substrate are not known. We aim to identify those mechanisms using a combined computational and experimental approach. The synergetic effects of combining the selected methods are expected to result in massive contributions to the LPMO and biorefining research fields. With detailed knowledge about the LPMOs reaction mechanisms, revealed structural and electronic determinants associated with enzymatic activity can be used to optimize LPMOs, change their substrate specificity, and alter the oxidation products. Also included in this project, is a route of rational enzyme design that aims to combine an in silico mutagenesis approach with in vitro experiments to create more efficient LPMOs. This is pioneering work that can be translated directly into the biofuel production technologies.