Environmental Barcoding of Aquatic Invertebrates

Vann er en uerstattelig naturlig ressurs som samtidig er sterkt påvirket av menneskelig aktivitet. Ferskvann er hjem til nærmere 100 000 arter, nesten 6% av det kjente artsmangfoldet på kloden. Mange av disse artene har spesifikke krav til miljøet de lever i og kan være gode indikatorer for vannkvalitet og forurensning. Allikevel blir en stor del av artsgruppene ikke vurdert i kartlegging og overvåkning av ferskvann fordi de er vanskelige å identifisere på ytre kjennetegn. Ved å lese små, karakteristiske deler av arvestoffet og sammenligne disse DNA-sekvensene med et kvalitetssikret referansebibliotek kan derimot alle livsstadier og kryptiske arter identifiseres med større sikkerhet. Denne bruken av standardiserte DNA-sekvenser til identifisering av arter kalles DNA-strekkoding. Nye avlesningsteknikker for DNA muliggjør storstilt DNA-sekvensering av miljø- og bulkprøver og kan revolusjonere måten vi vurderer og overvåker mangfoldet i ferskvann. DNA-metastrekkoding, som dette kalles, kan dermed bli et viktig verktøy for europeiske lands oppfølging av EUs Vanndirektiv. Vårt prosjekt har som mål å bidra til utviklingen av best mulig metodikk for DNA-metastrekkoding av virvelløse dyr i ferskvann. Vi har testet om ulike filter-typer, filter-preservering og prefiltrering påvirker hvilke arter som blir registrert ved analyse av miljø-DNA fra vannprøver. Resultatene viser at filter preservert på silica-gel eller i lysis buffer gir mest konsistente resultat, og at cellulosenitrat-filter gir mer stabile og bedre resultat enn polyetersulfon-filter. Pre-filtrering hadde ingen klar påvirkning på sammensetningen av registrerte arter fra miljø-DNA i vann (Majaneva et al. 2018a). Sortering av invertebrater fra bulkprøver kan være en svært tidkrevende prosess. Vi har derfor undersøkt om ulike måter å ekstrahere DNA fra usorterte bulk-prøver påvirker hvilke arter som kan påvises. Blant de testede ekstraksjonsmetodene ga Qiagens Power Plant Pro de mest konsistente resultatene, og verdier som korrelerte med prøvestørrelsen. Denne ekstraksjonsmetoden var også mest robust mot innblanding av PCR-inhiberende stoffer i innsjøsedimenter (Majaneva et a. 2018b). Resultatene våre viser at måten DNA preserveres og ekstraheres på er avgjørende for konklusjonene om hvilke organismer som finnet i et vassdrag. Den beste metodikken avhenger blant annet av vannets beskaffenhet (kvalitet) og prøvene inneholder sedimentrester. I siste delen av prosjektet har vi sammenlignet resultater fra tradisjonell identifisering av bunndyr med resultater fra DNA-metastrekkoding av de samme prøvene. Disse er igjen sammenlignet med DNA-metastrekkoding av vannprøver fra de samme lokalitetene. Endelige resultater vil være klare i løpet av høsten 2019. I likhet med funn i andre studier vi har vært med på (f.eks. Sun et al. 2019), forventer vi at DNA-metastrekkoding oppdager arter som vanskelig identifiseres morfologisk, men at noen arter også bare registreres med tradisjonell metodikk. Som en del av prosjektet har vi oppsummert kunnskapstatus om DNA-metastrekkoding av virvelløse dyr i ferskvann i en rapport til Miljødirektoratet. Rapporten vil bli utgitt i NTNU Vitenskapsmuseets naturhistoriske notatserie høsten 2019 (Ekrem & Majaneva 2019). Referanser Ekrem, T. & Majaneva, M. 2019. DNA-metastrekkoding til undersøkelser av invertebrater i ferskvann. ? NTNU Vitenskapsmuseet naturhistorisk notat 2019-x: 1-xx. Majaneva M, Diserud OH, Eagle SHC, Boström E, Hajibabaei M, Ekrem T (2018a) Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Scientific Reports 8, 4682. doi: 10.1038/s41598-018-23052-8. Majaneva M, Diserud OH, Eagle SHC, Hajibabaei M, Ekrem T (2018b) Choice of DNA extraction method affects DNA metabarcoding of unsorted invertebrate bulk samples. Metabarcoding and Metagenomics 2: e26664. doi: 10.3897/mbmg.2.26664 Sun, Z., M. Majaneva, E. Sokolova, S. Rauch, S. Meland & T. Ekrem, 2019. DNA metabarcoding adds valuable information for management of biodiversity in roadside stormwater ponds. Ecology and Evolution 00: 1? 11. doi: 10.1002/ece3.5503.

Prosjektet har: 1. Bidratt til større forståelse om hvordan miljø-DNA i ferskvann kan isoleres og analyseres. 2. Bidratt til kunnskap om ulike ekstraksjonsprotokoller for DNA fra bulkprøver av makroinvertebrater. 3. Styrket samarbeidet mellom NTNU Vitenskapsmuseet og nasjonale og internasjonale partnere. 4. Tilrettelagt for aktiv deltakelse i EUs COST-aksjon DNAqua-Net. 5. Gitt grunnlag for kunnskapsrapport til Miljødirektoratet om DNA-metastrekkoding av invertebrater i ferskvann. 6. Gitt kompetanse til å delta i et internasjonalt forskningsprosjekt finansiert av Nordisk ministerråd. 7. Gitt muligheten til å utvikle et fagområde ved NTNU som vil være viktig for fremtidig miljøovervåkning. 8. Lagt grunnlaget for bruk av metodikk i to PhD-grader, en mastergrad og to bachelorgrader med prosjektdeltakere som medveiledere. 9. Kommunisert resultater og kunnskap til allmenhet og fagfeller.

The possibility to identify species in environmental samples using short, standardised DNA fragments and Next Generation Sequencing (NGS) techniques has the potential to revolutionize the way we assess and monitor biodiversity in freshwater ecosystems. Here we suggest an experimental set-up to advance protocols for environmental barcoding through analysis of recent and historical samples from the reference watershed Atna and Lake Jonsvatnet in Central Norway. Our aim is to develop general best-practice procedures to maximise the effectiveness and accuracy of species-level identification at minimum cost using next generation sequencing techniques. By doing so in an international framework and including a post-doctoral position, we wish to promote knowledge transfer and capacity building among the partnering institutions and ensure recruitment of qualified personnel to this important area of nature research and management. Through collaboration with the Norwegian Environment Agency we will ensure that results are disseminated to relevant user groups.