Development of a plant biotechnology platform for low cost production of industrial enzymes to boost biorefinery of lignocellulose biomass

Andregenerasjonsbiodrivstoff anses som bærekraftig, og overvinner begrensningene og problemene med førstegenerasjonsbiodrivstoff ved å bruke ikke-matråstoffer, for eksempel skogsråvarer, skog- og jordbruksrester. Men det er mange utfordringer involvert i konvertering av lignocellulose-biomasse til biodrivstoff. Bioboost-prosjektet har målet å produsere billigere enzymer ved å utnytte tobakksplanter på en CO2-nøytral måte, dermed å redusere karbonavtrykket i tillegg til å produsere billige celleveggnedbrytingsenzymer. Med et konsortium som består av NIBIO (leder), NMBU, NTNU, samt internasjonale partnere Max Planck Institutt i Tyskland og Michigan State University i USA, og med god støtte av vår industripartner Borregaard, har vi gjennomført prosjektoppgavene i løpet av prosjektperiode fram til prosjektsluttsdato den 30. nov 2019. Samarbeidet mellom partnerne har gått veldig bra, og Bioboost-prosjektkonsortiet har produsert diverse resultater som vises på sluttrapporten og oppsummeres her. 1) Bioboost-prosjektet har forsket på utnyttelsen av grønne planter (den grønne fabrikken) for å produsere celleveggnedbrytingsenzymer for framtidens bioraffinering av lignocellulosisk biomasse. Vi valgte 4 kandidatenzymer som representerer en minimale enzymcocktail i nedbryting av forbehandlet lignocellulosebiomasse. Disse er TrCel5A, TrCel6A, TrCel7A og TrCel7B fra soppen Trichoderma. Alle enzymer er produsert i Nicotiana benthamiana planter, en slektning av tobakksplanter, ved bruk av NIBIOs plantetransformasjonsplattform. Dessuten ble genene som koder for flere viktige enzymer involvert i lignocellulosisk biomassekonvertering, Cel6B, Cel9A, Xeg74 og en thermostabil beta-glucosidase, BGLI, produsert i tobakksplanter ved bruk av kloroplasttransformasjon. Enzymer ble høyt uttrykt med normal vekst og fenotyp. Videre fokuserte prosjektpartnerne på analyser av disse 8 planteproduserte enzymer. 2) Ulike enzymatiske analyser ble utført på de N. benthamiana produserte TrCel5A, TrCel7B, TrCel7A og TrCel6A, med både NMBUs egen substrat og Borregaards Bali-substrat. Resultatet av enzymanalyser viste at planter og sopp har forskjellige glykosyleringsmønstre (N- og O-glykosylering). Dermed har vi analysert glykosyleringsmønsteret av vår planteprodusert TrCel7A sammenlignet med TrCel7A fra sopp, i samarbeid med glykosyleringsforskergruppen ved Universitetet i Oslo. Resultatene var meget interessant og ble publisert i et bra tidsskrift som heter Plant Biotechnology Journal i 2019 (van Eerde et al. 2019, doi: 10.1111/pbi.13227). De samme analysene (proteinanalyse, enzymaktivitetsanalyser og glykosyleringsstudie) ble utført på de andre planteproduserte enzymene TrCel5A, TrCel 6A og TrCel7B. Manuskripter basert på disse resultater forventes å bli publisert neste år. Dessuten har vi utført molekylære og enzymanalyser på Cel6B-, Cel9A-, Xeg74- og BGLI-enzymene, produsert i tobakkskloroplaster. Vi møtte med utfordringen av proteinstabilitet og løselighet som har vært tidskrevende. Resultatene vil være klar for vitenskapelig publikasjon i løpet av neste år. 3) Vi har gjennomført diverse studier på laccase LAC51-enzymet. Som rapportert i tidligere år, ble lac51 produsert i N. benthamiana-planter. Enzymaktivitetsanalysen viste et interessant resultat ved hjelp av en kommersiell substrat og ligninmonomer. Et manuskript basert på resultatene av planteprodusert LAC51 er snart klar til innsending. 4) I tillegg til å produsere de enzymene beskrevet ovenfor i planter, har vi også gjennomført genomstudie for å identifisere og karakterisere nye celleveggdegraderende enzymer i soppen Thermoascus aurantiacus, som er en varmekjær sopp som har blitt undersøkt grundig for sin evne til å produsere store mengder thermostabile enzymer for depolymerisering av cellulose og hemicellulose. Vi fant over 1500 gener som ble signifikant oppregulerte på gran sammenlignet med kontroll. Av disse har vi valgt ut tre laccase-kandidater til videre arbeid; disse laccasene er produsert i N. benthamiana planter og proteinanalyser pågår. 5) Bioboost-prosjektet er opptatt av formidling, kommunikasjon, publisering og prosjektsvirkninger og effekter: alle konsortiets partnere har presentert og disseminert Bioboost-prosjektet og presentert resultater på internasjonale og nasjonale konferanser, møter, seminarer og ikke minst i sosiale media. Vi har publisert både vitenskapelige artikler med referee og populærvitenskapelige artikler, foredrag/poster, samt oppslag i aviser og andre media, i tillegg til to konferanser som ble avholdt med stakeholderdeltagelser. Vi har spinnet off ett nytt EØS Norge-Romania prosjekt (EEA-RO-NO-2018-0078). Nettverket vi har etablert gjennom Bioboost videreføres i framtidig samarbeid og felles publikasjoner. Vi takker Norges forskningsråds ENERGIX-program for støtten til Bioboost prosjekt. Selv om Bioboost er avsluttet fortsetter Bioboost partnere å publisere resultater, kommuniserer kunnskapen vi har fått i Bioboost prosjekt.

Dette prosjektet har gitt virkninger på ulike områder både kortsiktig og langsiktig: 1) kompetansehevingen blant prosjektpartnerne. 2) Et langsiktig godt samarbeid mellom forskningsmiljø og næringsliv ble etablert, særlig med Borregård som våre viktige industripartner. Et spinn-off som viser virkningen av prosjektet er et nytt samarbeid gjennom NIBIOs Sinograin II Norge-Kinaprosjekt. 3) Bioboost-prosjektet har utnyttet plantebioteknologisktilnærminger for å produsere enzymer (ikke-mat og ikke-fôr produkter) i N. benthamiana planter. Bioboost-prosjektet har generert flere effekter gjennom prosjektperioden. Nasjonal og internasjonal samarbeid har blitt styrket. Tverrfaglig samarbeid mellom NIBIO, NMBU og NTNU er styrket. Samarbeidet med Max Planck Institutt i Tyskland og Michigan State universitet i Amerika har vært lærerikt og godt. Med Max Planck Institutt har NIBIO fått et nytt prosjekt som er et spin-off av Bioboost (EØS Norge-Romania prosjekt: EEA-RO-NO-2018-0078 SmartVac).

Summary: Sustainable and cost effective biorefinery of lignocellulose biomass for the production of biofuels and other higher value chemicals requires a large amount of enzymes. However, the cost of enzyme is a well-known bottleneck in present lignocellulose biorefinery. We propose here Bioboost, a research project building upon a previous "Greenzyme" concept, one of the 12 finalists during 2013 "new concept" competition but with some fresh input from our pilot experiments. Bioboost aims to develop a plant biotechnology platform for low cost production of key cell wall degrading enzymes (CWDEs) to boost biorefinery of lignocellulose biomass. We use tobacco, a non-food and non-feed crop (a primary CO2 binder), instead of energy demanding fermenter-based systems. Tobacco is an ideal choice for the production of key CWDEs because of its feasibility for genetic manipulation, excellent biomass (ca. 40 tons of leaf fresh weight/acre) and prolific seed production (ca. one million seeds per plant), thus hastening the time in which a product can be scaled up and brought to market. For proof-of-principle, we will express enzymes comprising minimal cocktails (including endocellulases, cellobiohydrolases, beta-glucosidase, and lytic polysaccharide monooxygenases) screened and identified as optimal for converting pretreated lignocellulose substrates in our consortium partner Eijsink's laboratory. Bioboost is organized in 6 workpackages (WPs) covering (i) effective management and successful dissemination of project results to the relevant stakeholders (WP1 and WP6); (ii) low cost production of key CWDEs in tobacco (WPs 2-3); (iii) Functionality and impacts of tobacco produced recombinant CWDEs (WP4-5). The WPs will be fulfilled by a consortium consisting of national and international partners with outstanding scientific expertise in plant genetic engineering, cell wall degrading enzymes and cell wall architecture, and an experienced industrial partner, Borregaard.