ANAVAC - A combined tissue culture and reverse vaccinology approach to develop a vaccine against Anaplasma phagocytophilum in sheep.

Anaplasma phagocytophilum forårsaker sjodogg (TBF) hos småfe og bakterien er påvist i flere dyrearter, inkludert mennesker. I Norge beiter ca. 850.000 sau på flåttinfiserte beiter og rundt 500.000 av disse er i aldersgrupper som er mest mottakelige for flåttsykdom, hovedsakelig lam. Beregninger viser at om lag 300,000 til 400,000 lam blir smittet med sjodogg årlig. Sykdom og død fører til store økonomiske tap og redusert dyrevelferd som følge av nedsatt motstandsevne mot sekundærinfeksjoner (for eksempel Stafylokokker). Vaksiner mot sjodogg har ikke vært laget tidligere og langtidsvirkende og bredspektret antibiotika har derfor tradisjonelt vært brukt i behandling og forebygging mot sjodogg. Det er imidlertid en økende bekymring for miljøkonsekvenser og folkehelse knyttet til utstrakt bruk av antibiotika i landbruket og muligheter for utvikling av antibiotikaresistens. Nye metoder for beskyttelse mot flåttinfeksjoner er derfor nødvendig. Dette prosjektet har utredet og testet biologiske komponenter som har vært tenkt, kan benyttes i arbeidet med å utvikle effektive vaksinekandidater mot sjodogg hos sau. Prosjektet har studert immunresponsen mot levende bakterier og klonede organismer som uttrykker beskyttende proteiner. Effekten av ulike vaksinekandidater har blitt vurdert på bakgrunn av deres evne til å produsere en immunologisk reaksjon etter vaksinering og evnen til å hindre organismer i å overføres fra flått og etablere en infeksjon. Prosjektet har utført to dyreforsøk med sau som modell. To proteinvaksiner og tre levende vaksine er testet. De levende vaksinene er basert på genmodifisering av bakteriens DNA. Forskning med genmodifiserte mikroorganismer krever godkjenning, som ble innvilget av Mattilsynet, Helsedirektoratet og Miljødirektoratet. I tillegg har det blitt gjort undersøkelser av vert-patogeninteraksjoner basert på RNA-sekvensering fra genmateriale hos dyr og bakterie. Her har vi sett på hvilke immunologiske prosesser som skrus av og på som respons på infeksjonen. Resultatene viser at det er respons mot en proteinbasert vaksine basert på måling av antistoffer. Det er lite som tyder på at de undersøkte overflateproteinene som er benyttet i denne vaksinen, beskytter mot infeksjon eller gir en større beskyttelse enn i dyr som får placebovaksine (uten antigen). Det er likevel interessant og viktig at disse vaksinekandidatene ikke gir en ønsket respons. Dette er viktig informasjon om at rollen til disse proteinene som er uttrykt på bakterieoverflaten, antakelig ikke er viktige for å skape en immunitet. Derfor må andre proteiner og signalmolekyler undersøkes. Tidligere studier har også vist at proteiner hos Anaplasma kan gi en sterk immunrespons, men ikke beskyttelse mot smitte. Prosjektet har jobbet med å analysere effekten av tre ulike genmodifiserte Anaplasmabakterier. Disse modifiserte bakteriene har fått tilført et gen som gjør at de uttrykker fluorosens og antibiotikaresistens. Når det settes inn et nytt gen, kan et annet gen brytes slik at det inaktiveres. Derfor er det sannsynlig at bakterien mister noen egenskaper som er viktige for at den skal kunne infisere et vertsdyr eller at det fører til en redusert infeksjon. Fluoresens og antibiotikaresistens gjorde at vi kunne overvåke utviklingen av kulturene. Resultatene peker på at disse endringene i genomet til bakteriene, ikke fører til en betydelig svekkelse av virulensegenskaper. De er i stand til å produsere sykdom på lik linje med villtyper av bakterien. Det mest interessante virker å være at villtypen gir en fullstendig immunitet ved smitte, mens de muterte stammene ikke gir samme immunitet og fører til at dyrene kan smittes på nytt. Prosjektet har også undersøkt hvordan et dyr (lam) og bakterien reagerer på hverandre. Når bakterien smitter dyret, vil dette sette i gang en stor kaskade av responser hos dyret for å kvitte seg med inntrengeren. Immunforsvaret vil aktiveres på mange nivåer og sykdommen vil påvirke fysiologien til vertsdyret. RNA (ribonukleinsyre) er koder for hvordan kroppen skal reagere på stimuli. Når det produseres mye RNA for en egenskap (for eksempel et protein), vil det lages mer av akkurat dette proteinet. RNA er derfor viktig for å regulere hvordan kroppen virker til enhver tid. Når vi ser på RNA fra både dyr og bakterie gjennom en infeksjon, kan vi bedre forstå hva bakterien gjør med dyret og hvilke kontaktpunkter som er viktige i immunforsvaret hos dyret. Resultatene av dette arbeidet viser at det er mulige kjønnsforskjeller hos lam i hvilke deler av immunforsvaret som aktiveres til enhver tid. Det er også mye som tyder på at det er prosesser som aktiverer det cellulære immunforsvaret, som er dominerende i infeksjonen med Anaplasma. Dette har man tidligere sett under prøvetaking av infiserte dyr, men nå kan vi se i dypbden på hvilke responser bakterien aktiverer hos dyret. Dette vil være svært viktig informasjon for det videre arbeidet med vaksiner og forståelse av hvordan vi kan forebygge infeksjoner.

The project had international and interdisciplinary collaboration between Norway, Sweden and the United States within the field of Rickettsial vaccinology. Exchange of people and knowledge has been one primary goal of this project, that has been achieved with great success. One PhD student visited two of the most experienced research groups in the field across the world in both Florida and Minnesota. One leading researcher from Florida visited Norway to assist in inoculation of lambs with mutated bacteria. In addition, several physical visits have been made between Norway and Sweden and the results of the project has been presented at international conferences in Europe and the US. The consortium has earned international attention through the project and interesting potential collaboration has been established parallel to the project. Skills and knowledge related to vaccinology of Anaplasma has been gained that will be basis for future projects in collaboration between nations.

The tick-borne rickettsia Anaplasma phagocytophilum has been detected in several mammalian species, including sheep and humans. In Norway approximately 850.000 sheep are exposed to ticks on pastures of which 500.000 are lambs. Estimates show that approximately 300.000-400.000 lambs are infected annually The main disease problems associated with TBF in ruminants are seen in young animals and result in large economic and welfare implications due to immunosuppressive effect of the bacterium which is accompanied by secondary bacterial infections. Estimates have shown that the disease leads to total indirect losses of more than 30 mill. NOK annually. However, the total cost due to TBF in Norway may be much higher due to direct losses from deaths and crippling staphylococcal infection. Vaccines against A. phagocytophilum are currently not available. Prophylaxis is mostly done by a variety of pour-on applications and long-acting tetracycline has also been used as a prophylactic measure. However, there is a growing concern about the environmental safety and human health, rising antibiotic resistance in target- and non-target bacteria, increasing costs of chemical control and the increasing resistance of ticks to pesticides. The main knowledge need is to find bacterial components that can be used to develop an effective vaccine against the higly virulent and prevalent strains of A. phagocytophilum in Norwegian sheep production. The project will identify vaccine candidates by studying the immunizing effect of live whole cell bacteria, as well as recombinant organisms expressing protective protein subunits, using a reverse vaccinology approach. The efficacy of different vaccine candidates will be evaluated based on their ability to produce a measurable immunological response upon vaccination, their safety in vaccinated animals, and their ability to prevent colonization and persistence of the organism upon challenge. The project will apply global RNA sequencing as a method to study the host-pathogen interface using mutated organisms and wild type bacteria as exposure factors. The goal is to detect changes in the gene expression related to the animal immune system when meeting a bacterium that is authentic or mutated. By studying the expression profiles, the goal is to find genes that are either up-regulated or down-regulated as a response to the genome structure in the bacterium. If a genetic change in the bacterium is able to shift a part of the immune system of the host in either direction, we may be able to manipulate or construct an antigen that can be used as a vaccine candidate with a known function.