Novel Live Cell Imaging and Genome Wide Approaches to Elucidate the Dynamic Roles of Reversible mRNA Modifications in Pluripotency

Pluripotens omhandler evnen embryonale stamceller har til å differensiere i ulike typer vev. N6-metyladenosin (m6A) mRNA-modifisering påvirker RNA-metabolismen. Hvordan m6A-modifisering av RNA regulerer pluripotens er lite kjent. Mens noen studier har rapportert pluripotensitet i m6A modifiserte celler har andre påvist manglende evne til celle diferensiering. Vi fant at lave m6A-konsentrasjoner fører til aktiveing av Erk-signalering som igjen fremmer differensiering og Akt-avhengig stimulering av pluripotens. Begge disse signaleringsveiene blir aktivert i celler med lav m6A forekomst som et resultat av økt stabilisering av FGF5 mRNA og økt aktivering av FGF-reseptor. Ved å bruke en banebrytende metode for analyse av enkeltceller har vi kvantifisert proteinnivået av pluripotency transkripsjonsfaktorer i flere tusen embryonale stamceller fra mus. Inaktivering av m6A fører til inaktivering av pluripotency-nettverket i celler som er mer utsatt for differensiering. Alternativt fremmer inaktivering av m6A Erk-aktivering og robust pluripotens. Hyperpluripotente m6A-negative celler, som ikke er i stand til å spesifisere avstamning, kan aktivere Erk på nytt under gitte betingelser og således gradvis bidra til å nedregulere transkripsjonsfaktorer som bidrar til pluripotens. I motsetning til hva man tidligere har hantatt, viser funnene våre at m6A-inaktivering endrer cellene sin signaleringsstruktur. Dette fremmer aktivering av pluripotens-transkripsjonsfaktorer som igjen fører en omprogramering av pluripotens nettverket.

The project generated a comprehensive manuscript which we believe is of the highest international relevance and standing. We therefore expect that the submitted manuscript will be published in a very high impact factor, peer review journal. The project will also result in the completion and graduation of Mr Kangxuan Jin from the Oslo University PhD Program.

We aim to describe the role of dynamic methylation on mRNA in the control of pluripotency and during its acquisition upon cell reprogramming. Pluripotency is the unique ability for a cell to differentiate into all cell lineages of the body, including mesoderm, ectoderm and endoderm. However, knowledge about the putative role of reversible 6-methyladenine (m6A) modifications on mRNA in stem cell biology is currently in its infancy. The three m6A stem cell studies to date are partially at odds about the precise role of m6A regulation in pluripotency. To clear long-standing debates, we developed double knock-in protein fusion pluripotency reporter stem cell lines and cutting edge live time-lapse imaging approaches. We can monitor heterogeneous and dynamic pluripotent state and/or cell reprogramming choices in response to m6A regulator manipulation. Cell subpopulations of interest, isolated by flow cytometric sorting will undergo innovative, high-throughput genome wide analyses to pinpoint mechanisms behind state transitions. We believe that the project is central to three of the four key objectives; 1) Understanding the impact of m6A regulation in pluripotency and reprogramming. 2) Characterization of novel pluripotency regulatory mechanisms. 3) Discovery of new methods to control stem cell state with profound advantages for long-term cell therapy applications.