ACCELERATED EVOLUTION IN CHORDATES AND THE ORIGIN OF LARVACEANS

Dette TOPPFORSK-prosjektet tar sikte på å studere samtidige evolusjoner av tunikatgenom og utvikling og til slutt å forstå hvordan endring av forfedrenes akkordgenomer har ført til en regressiv-lignende endring av anatomisk kompleksitet. På den genomiske siden er eksperimentelt arbeid nå fullført, og i tillegg til tre publikasjoner som allerede er publisert, er to eller tre manuskripter planlagt. To vil handle om utviklingsdelen av prosjektet, og en tredje er fortsatt avhengig av eksperimenter på spleisemekanismer. (1) Divergensen av DNA-reparasjon i dobbeltstrengsbrudd (DSB) , med Oikopleura og andre larver som har mistet gener og funksjoner for ikke-homolog endeforbindelse (NHEJ), som eksperimentelt demonstrert ved bruk av DNA-injeksjoner av lineært DNA og CRISPR-induserte mutasjoner. DSB repareres ved hjelp av en alternativ mekanisme som utnytter mikrohomologier på hver side av pausen (MMEJ-lignende). Ytterligere og senere eksperiment har testet effekten av å slå ned spillerne av MMEJ -mekanismen (RNAi og hemmere), men ingen konklusjon kan nås så langt. Nye prosjekter vil bli utarbeidet for å identifisere spillerne gjennom biokjemisk identifisering av molekyler knyttet til dobbeltstrengbruddene. (2) En sammenheng mellom larvenes genomstørrelse og mengden av ikke-autonome retrotransponerbare elementer (spesielt SINE) ble avdekket og publisert våren 2019. Forfedrenes genom var sannsynligvis lite og ble utvidet gjennom invasjoner av disse elementene, drevet av autonome motstykke som ikke er påvist i genomet. Dette er en ganske original situasjon som kan gjenspeile spesifikke strategier for transponerbare elementer til å operere, til tross for deres strenge kontroll med genom som er motstansddyktige mot inntrengere. For å forfølge dette emnet har det blitt besluttet å utforske og beskrive mange nye beslektede genomer som dukket opp etter den verdensomspennende samlingen og sekvensering av marine organismer (Tara-ekspedisjonen). Allerede tretti appendikulære genom er påvist og satt sammen. (3) Invasjon av gener i en familie av larvesekkedyr arter av et stort antall ikke-kanoniske introner. Disse stammer utvilsomt fra ikke-autonome DNA-transponerbare elementer (MITE), dette fenomenet har tidligere blitt observert hos noen få encellede organismer, men ikke hos dyr. Utover avgang fra kanoniske spleisesteder, er det brede mangfoldet av ikke-kanoniske spleisesteder slående og reiser spørsmål om hvordan de kan spleises ut. Ulike eksperimenter viser at dette er gjort av et U2 -spleisosome som må ha blitt modifisert. Den nøyaktige typen av modifikasjonene er ukjent, og vil være spørsmålet i en annen stor tilskuddssøknad.Nåværende resultater ble publisert i slutten av 2019. To strategier er utarbeidet, en basert på en klassisk disseksjon av spleisemekanismer med biokjemi, den andre handler om å studere funksjonen til et par dupliserte spleisefaktorer, som kan ha utviklet seg til å behandle ikke-kanoniske introner. Utviklingssiden av prosjektet ble til slutt styrket av en god kontroll over CRISPR -teknologien som vi opprinnelig etablerte for ovennevnte DNA -reparasjonsprosjekt. Selv om det er lett å mutere celler i embryoet, er det mer utfordrende å skaffe stabile mutantlinjer for viktige utviklingsgener. Dette var imidlertid mulig for fire homeobox -gener. (4) Mutantlinjer er oppnådd for Pax37B (involvert i utviklingen av husets epitel, en innovasjon av larver) og for Hox1 (funksjonen til Hox-gener i tunikaer er i det vesentlige ukjent). Homozygote mutanter viser en fenotype med et fravær av de største epitelcellene for Pax37B, de som produserer matkonsentrasjonsfilteret til dyrehuset. Dette virker tilstrekkelig for å provosere død av ungdommer som ikke ville være i stand til å samle mat. Mer detaljert analyse avslørte at en av cellene kan være til stede, og stiller spørsmål om utviklingsmekanismen som er involvert og dens genetiske variasjon. (5) Som rapportert tidligere er Hox1 -tapet av funksjonsmutant også dødelig, men kompromitterer ikke den tidlige utviklingen. Mutanter viser en delvis lammelse av larver og endring av stammen til halevinkelen. Uttrykk av forskjellige markører uttrykt rundt halestamkrysset blir undersøkt for å forstå hvor akkurat den fenotypiske endringen kommer fra. (6) For både disse mutantene og andre i fremtiden er transkriptomstudier engasjert i sammenligning med villtypekontroller for å identifisere gener som indirekte eller direkte reguleres av de muterte genene. Slik analyse lyktes imidlertid ikke, muligens på grunn av flere ekspresjonssteder. En løsning bør være analyse av transkriptom i enkeltceller, og vi har begynt å etablere metoden for enkelcellesekvensering for tidlige utviklingsstadier i Oikopleura. Dette kan gjøre det mulig å svare på om andre gener av de samme genetiske opphav også ble kooperert for epitelfunksjonen sammen med Pax37B, samt for de ukjente mekanismene som Hox1 bidrar til.

The main outcomes are the surprising discoveries of new molecular mechanisms influencing genome evolution. The impact is the necessity for a broad scientific community to reconsider part of the knowledge in textbooks, which basically says that such mechanisms are universally conserved since found in yeast and in human. One example is the loss of an essential DNA repair pathway (NHEJ), the other is the invasion of the genome and process of a multitude of diverse non-canonical introns. The other outcomes are for the establishment of critical technologies in Oikopleura, such as CRISPR, genome sequencing in planktonic animals and currently single cell transcriptome sequencing, but the impact here is restricted to a smaller number of research teams.

The evolution of multicellular organisms is generally seen as a process gradually increasing their anatomical and physiological complexity, through the recurrent addition of lineage-specific innovations. The molecular analysis of phenotypical changes in relatively small taxons (to which belong genetically tractable model systems) suggests that modifications of gene regulation is their main driver, rather than changes in the complement of genes. However, classical zoological studies and/or recent phylogenomics have recognized multiple cases where complexity has been reduced more or less dramatically. In such situations, important changes of the genome from those of more complex ancestors may be observed, including significant gene losses or a relaxation of genome architecture. Despite considerable knowledge of the vertebrates and their historical radiations, the history of the chordate phylum (to which they belong) remains very enigmatic, in part because non-vertebrate chordates have left little and often puzzling fossil records. The present project is on the evolution of larvaceans, a major component found in the plankton of all oceans. Larvaceans belong to the chordate subphylum of tunicates, which we found to be the sister group of vertebrates, despite their strikingly simpler anatomy. Our goal is to reconstruct their history from tunicate and chordate ancestors, during which evolution was strongly accelerated. We propose to examine the correlation between rapid genome changes and the divergence of developmental mechanisms in larvaceans. Our project has three main objectives (i) to better understand how reduction of anatomical complexity and a major lineage-specific innovation could be achieved through changes of developmental mechanisms, (ii) to correlate the changes of developmental mechanisms with accelerated genome modifications, (iii) to facilitate the project by improving methodologies.