Modeling tumor heterogeneity in colorectal cancer management

Tykk- og endetarmskreft (heretter tarmkreft) er en av de mest vanlige krefttypene i Norge. Én og samme svulst i tarmen kan ha stor molekylær variasjon, kalt tumorheterogenitet, som medfører et stort potensial for spredning. Tarmkreft sprer seg ofte til leveren, og pasientene kan få flere spredningssvulster, som kan ha høy molekylær heterogenitet seg i mellom. Det kan medføre varierende effekt av legemiddelbehandling. Dette prosjektet ble startet for å gi mer kunnskap om betydningen av tumorheterogenitet for sykdomsutvikling og respons på behandling. Vi har undersøkt heterogenitet innad i den primære svulsten i tarmen, mellom den primære svulsten og senere spredningsvulster (metastaser), og blant metastaser i samme pasient. Vi har kombinert en rekke teknologier og metoder som spenner fra genetiske analyser til radiologiske bildevurderinger og legemiddelutprøvning i modeller dyrket fra pasientenes egne kreftceller. Vi har vist at kjente biomarkører for tarmkreft har ulik betydning avhengig av svulstenes øvrige biologiske egenskaper. Tarmkreftsvulster kan inndeles i fire biologiske grupper (CMS1-4) basert på uttrykket av gener. Biomarkørers utsagnskraft for pasienters prognose og respons på behandling styrkes ved å ta hensyn til hvilken undergruppe svulsten tilhører (Smeby et al, AnnOncol 2018; ESMO Open 2019; Berg et al, Oncogene 2019; Eilertsen et al, Cancer Letters 2020). Denne grupperingen er også et grunnlag for å identifisere nye effektive legemidler (Sveen et al, Clin Cancer Res 2018). Men vi har oppdaget at 40% av svulstene kan tilhøre flere biologiske undergrupper, og at klassifiseringen avhenger av hvilket område av svulsten prøven er tatt fra (Langerud et al, upublisert). Dette kan i stor grad forklares med at svulstene har et varierende mikromiljø, som består av ulike infiltrerende celletyper med støttefunksjon i svulsten. Mikromiljøet har i seg selv betydning for pasientenes overlevelse (Dienstmann et al, AnnOncol 2019), men heterogenitet i de biologiske gruppene har sterkere negative betydning. Vi har laget et nytt klassifiseringssystem som ikke varierer i ulike områder av samme svulst (Langerud et al, upublisert). Metastaser vokser i et annet mikromiljø enn svulstene i tarmen, og vi har vist at de kjente biologiske undergruppene derfor ikke er velegnede for pasienter med spredning (Eide et al, NPJ Genom Med 2021). Vi identifiserte nye biologiske undergrupper av levermetastaser (LMS1-5; Moosavi et al, Genome Med 2021). Den gruppen (LMS1) som finnes i pasienter med aller verst sykdomsforløp er samtidig den som er minst sårbar for heterogenitet. For andre typer molekylære endringer, som avvik i DNA, er heterogenitet blant levermetastaser i seg selv et tegn på dårlig prognose og tidlig tilbakefall etter operasjon (Brunsell et al, Clin Colorectal Cancer 2020; Berg et al, Mol Oncol 2021). Ulike biomarkører for tarmkreft kan opptre samtidig og påvirke hverandre. Dette gjør fortolkningen kompleks (Sveen et al, Nat Rev Clin Oncol 2020). Vi har oppdaget biomarkører for pasienters prognose også basert på uttrykket av ulike varianter av hvert gen. Dette er et resultat av prosessen alternativ spleising, som ofte er forstyrret i kreftsvulster (Eilertsen et al, Int J Cancer 2018 og upublisert). Fem personer (stipendiater, postdoktorer og forsker) har vært ansatt i prosjektet og for å etablere avanserte lab-teknologier og bioinformatiske analyser. Vi har etablert fluoresensbasert immunhistokjemi for å analysere uttrykket av flere proteiner på samme vevssnitt (Lopes et al, Lab Invest 2020; Kryeziu et al, BBA Rev on Cancer 2022). Ved hjelp av denne teknologien har vi validert to biomarkører (RCC2 og CDX2) som kan forutsi pasienters prognose og effekten av cellegift (RCC2 og CDX2; Bruun et al, Mol Oncol 2019 og 2022; Bergsland et al, ESMO Open 2020). Vi har oppdaget at den romlige fordelingen og interaksjonen mellom ulike immunceller i svulstenes mikromiljøet har betydning for pasientens sykdomsforløp (Bergsland et al, Modern Pathol 2022; Åsebø et al, Brit J Ca 2022). Vi har også etablert en «levende biobank» av personlige kreftmodeller, dyrket som tredimensjonale cellekulturer, såkalte organoider, av pasientenes egne levermetastaser. Den levende biobanken består nå av 200 organoider fra 100 pasienter. Molekylære analyser og legemiddelutprøvning i organoidene benyttes til å nominere det mest effektive legemiddelet for den enkelte pasient (Bruun et al, Clin Cancer Res 2020, Kryeziu et al, J Transl Med 2021). Basert på dette har vi i 2022 igangssatt en klinisk studie for presisjonsbehandling av metastastisk tarmkreft (EVIDENT). Blant de 23 legemidlene som er godkjent for bruk i studien, mottar pasientene den medisinen som er vist å være mest effektiv mot egne svulster. Vi dyrker og tester flere metastaser fra hver pasient for å unngå å nominere legemidler med varierende effekt mellom de enkelte metastaser (Brunsell et al, Eur J Surg Oncol 2019). Slik håper vi å redusere fremveksten av motstandsdyktige svulster

This research project has demonstrated that tumor heterogeneity in colorectal cancer is pronounced on several molecular levels (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) and across sample comparisons (intra-tumor heterogeneity, primary-metastasis heterogeneity, inter-metastatic heterogeneity). This is a major complicating factor for the interpretation of tumor biomarkers (Sveen, Kopetz, Lothe Nat Rev Clin Oncol 2020) not at least in the clinical setting. Tumor heterogeneity has a negative impact on patient survival in several stages of the disease. We have developed novel tools, including liver metastases subtype (LMS) framework and shown that the subtype least vulnerable for heterogeneity identify the patients with largest risk for relapse. This demonstrates the strength of molecular analyses in a tumor heterogeneity context. The LMS framework was approved for patent application through Inven2 and further financed by the U of Oslo. The aim is to demonstrate that the patient group with the high risk LMS metastases show response to drugs not currently provided to these patients. The project results have been the foundation for a clinical intervention trial for patients with CRC liver metastases; EVIDENT – “ex vivo drug sensitivity testing” a one armed phase II trial treating patients based on the drug sensitivities found in three dimensional models (organoids) established from their own tumors in the context of heterogeneity (several lesions per patient are testet). EVIDENT was opened in March 2022 and represents a new generation of precision medicine, functional oncology not depended on biomarker guided treatment, and with a strong potential to improve the treatment benefit for the patient. If the strategy is confirmed valuable, it will lead to initiation of several follow-up trials to improve treatment benefit in the first-line and to expand to patients nation-wide. The potential of this trial is recognized by the Norwegian Centre for Clinical Research by recent financial support. This project has contributed to “open science”. Most of our publications are open access and large molecular datasets and resources have been made available in the public domain. Furthermore, bioinformatic algorithms for tumor classification have been developed and shared. The living biobank for functional studies in pre-clinical cancer models that show a strong recapitulation of the biological profiles of their original tumors is a unique and important resource for further research. This in combination with the strong local competence will contribute to implement the functional oncology set-up for more patients, for other indications in a core facility or a diagnostic department. The project has contributed to consolidation and strengthening of the multidisciplinary research collaborations of CRC nationally and internationally. In the long term an impact of our results can be clinical implementation of functional oncology for solid tumors nation-wide.

Tumor heterogeneity has in recent years once again become an international focus area for cancer research paralleling the development of technology, in particular next generation sequencing and microarray-based methodologies. However, the impact of tumor heterogeneity on disease progression, treatment response, and the value of known biomarkers, is poorly understood. Our research team is well situated to explore new ideas and discover the clinical relevance of heterogeneity in colorectal cancer. This proposal builds on a long term translational research program for colorectal cancer, led by the applicant. The proposal includes three WPs that deal with three different types of intra-individual heterogeneity, first: the clonal composition of individual primary carcinoma, second: the change of subclonal composition over time in disease progression potentially due to selection pressure after treatment and third: tumor heterogeneity within and among multiple tumors in single patients. These are accompanied by WPs to explore the potential clinical benefit of heterogeneity. WP4 hypothesizes that the tumor heterogeneity will be recapitulated in liquid biopsies and therefore useful for monitoring patients. In WP5 we suggest that genomic heterogeneity assessed by integration of mutation profile and DNA copy number changes will improve accuracy in subclonal composition and identify early stage patient subgroups with particular poor prognosis. Finally, we hypothesize that driver signatures within the genomic heterogeneity feature can be extracted through integration with corresponding expression data of affected pathways, which will be validated by population based heterogeneity studies using florescence in situ hybridization of multiple proteins on tissue sections.