Pan-genome analysis of the fish pathogen Aeromonas salmonicida with focus on genetic determinants for host specificity.

Lakselus er en av de viktigste truslene mot norsk lakseoppdrettsnæring, og ulike arter av rensefisk benyttes i utstrakt grad for biologisk kontroll av lakselus. Helsesituasjonen blant rensefisk i dag er imidlertid uholdbar, da bortimot all rensefisken i et anlegg dør i løpet av et lakseinnsett. Infeksjon med bakterien Aeromonas salmonicida representerer en av de viktigste tapsårsakene blant rensefisk i oppdrettsanlegg. Denne bakterien er kjent, på verdensbasis, for å gi sykdom i et stort antall fiskearter i både ferskvann og sjø. Historisk har imidlertid hovedfokus vært på stammer tilhørende sub-arten A. salmonicida subsp. salmonicida (også kjent som 'typiske' A. salmonicida), som primært infiserer laksefisk. Andre fiskearter, inkludert rensefisk, er mer utsatt for andre sub-arter/-typer av A. salmonicida (kollektivt beskrevet som 'atypiske' A. salmonicida), og denne meget mangfoldige gruppen er fremdeles svært dårlig beskrevet og systematisert. Dette har bl.a. vanskeliggjort vaksineutvikling og utførelse av etterprøvbare studier på 'atypisk' A. salmonicida. En tidligere studie utført av oss fant at A. salmonicida ('typiske' og 'atypiske') kan inndeles i ulike sub-typer (A-lag typer), basert på sekvensering av genet som koder for et proteinlag (A-laget) som eksponeres på utsiden av bakteriecellen. Hver av de identifiserte A-lags typene virker videre å gi sykdom kun i noen få spesifikke fiskearter, og det er primært to slike A-lagstyper av A. salmonicida som påvises i rensefisk, både i Norge og på de britiske øyer. Ved å utvide spekteret av A-lagstypede A. salmonicida isolater ytterligere mtp. opphav (vert, geografi, tid) vil vi kunne gå videre medønsket vi å danne grunnlag for utvalg til helgenomsekvensering (WGS) av et en globalt dekkende utvalg samling isolater. med pPåfølgende bioinformatiske analyser vil da gi oss en godfor å få en oversikt over populasjonsstrukturen til denne bakteriearten som helhet., og s Dette ville samtidig kunne legge til rette for en bedre forståelse av bakgrunnen for den tilsynelatende vertsspesifisiteten. Slik grunnleggende kunnskap vil bl.a. kunne anvendes til optimalisering av tapsbegrensende tiltak mot A. salmonicida, både hos rensefisk og andre mottakelige fiskearter. Per oktober 2018 har vi utvidet vår A. salmonicida samling til ca. 700 isolater, funnet fra 50 forskjellige fiskearter i 26 land. A-lagstyping av dette omfattende materialet har identifisert et tjuetalls A-lagstyper, og støtter godt oppunder teorien om at ulike subtyper av denne bakterien har smale og spesifikke vertsspektre. Publisering av dette arbeidet er under utarbeidelse. Et utvalg representative isolater fra hver A-lags type har videre blitt genomsekvensert, og vi har nå i underkant av 200 ferdig sammenstilte A. salmonicida genomer tilgjengelig for bioinformatiske analyser, som er pågående. Gjennom prosjektperioden og frem til prosjektets slutt har vi derfor opparbeidet en stor samling av ca. 700 A. salmonicida isolater fra 50 forskjellige fiskearter i 26 land, som så ble A-laget sekvensert. Disse fordelte seg på 23 tydelige A-lagstyper, hvorav de fleste forekom kun i et lite utvalg fiskearter. Dette arbeidet vil kunne vise seg svært relevant for fremtidig vaksineutvikling mot denne bakterien. Videre har vi helgenomsekvensert utvalgte isolater fra hver av A-lagstypene, og gjennomført bioinformatiske analyser på dette materialet. Genomer fra totalt 196 A. salmonicida isolater ble inkludert i det endelige datasettet, og danner således grunnlaget for den mest omfattende populasjonsstudien av denne bakterien som noen gang er gjort. Fra dette fremstår det umiddelbart som tydelig at dagens systematisk inndeling av arten er uhensiktsmessig og bør omorganiseres. Videre gir resultatene bl.a. innblikk i hvordan noen A. salmonicida stammer kan ha blitt spredt rundt om i verden med transport av kultivert fisk, mens andre trolig fremdeles er geografisk begrenset sammen med de viltlevende fiskeartene som de infiserer. På mobile genetiske elementer identifiseres og beskrives gener av betydning for bakterien evne til å gi sykdom, og vi finner at stammer som har vært i nær kontakt med menneskelig aktivitet inneholder et langt høyere innslag av gener som gir antibiotikaresistens.

A-lags typing, i kombinasjon med det globalt dekkende datasettet med A-lags typede Aeromonas salmonicida isolater publisert gjennom prosjektet, benyttes i dag av Veterinærinstituttet samt kommersielle aktører (f.eks. vaksineprodusenter og diagnostiske laber) i Norge, og trolig utenlands, til å karakterisere denne bakterien. De 151 sekvenserte genomene vil (ved publisering av artikkel) tilgjengeliggjøres gjennom en offentlig internasjonal database. Den enorme mengden informasjon som ligger i dette datasettet vil kunne vise seg svært verdifull for andre forskere som jobber med denne bakterien, og vårt arbeid med det har bidratt til å heve den bioinformatiske kompetansen ved Veterinærinstituttet. Samarbeidet med verdensledende internasjonale forskere innen fagfeltet har videre gitt spin-offs i form av nyoppstartede forskningsprosjekter. MLVA genotyping metoden planlegges anvendt til å utforske epidemiologien rundt furunkulose i villaks i Norge generelt og i Namsen-vassdraget spesielt.

Salmon lice are one of the most important threats in Norwegian salmonid aquaculture and cleaner fish of several species are used for biological control of salmon lice. The health situation in cleaner fish species is both alarming and unsustainable, with almost total loss of cleaner-fish during the salmon culture cycle being relatively common. Acute bacterial disease, particularly infection with Aeromonas salmonicida, is the most common diagnostic finding. A. salmonicida is a very important and almost ubiquitous pathogen in many species of fish. Without exception, all marine fish species introduced to aquaculture in recent years in Norway, including lumpsucker, ballan wrasse, turbot, halibut, cod and wolffish, have been identified as susceptible to A. salmonicida infection. There is a need for development of prophylactic measures including vaccination against this bacterium. The species A. salmonicida comprises a wide range of genetically and phenotypically diverse strains however, and a lack for comprehensive, resolute and unambiguous subtyping systems have hampered research on the bacterium. This particularly applies to so-called ‘atypical’ A. salmoncida strains, which are highly diverse and frequently infect non-salmonid fish species, including wrasse and lumpsucker. Our group (Gulla et al. 2015) recently published the first systematic typing system for A. salmonicida, based on sequence variation in the vapA gene (coding for the extracellular A-layer in A. salmonicida). This A-layer typing system separates all five recognised subspecies, identifies several new clusters which may well represent additional, as yet undescribed subspecies, and identifies a significant degree of host specificity in many of these clusters. By further expanding the collection (with regard to origin) of A. salmonicida strains investigated by A-layer typing we will make a selection for whole genome sequencing. This will allow in-depth investigations into the pan-genome and overall population structure of this important fish pathogen, while also facilitating identification of additional elements associated with its apparent host specificity. The project may well result in spin-offs relating to vaccine optimisation.