Implementing gene-based assays on a robotized genosensor for environmental surveillance in offshore marine operations

For å møte myndighetenes og samfunnets krav til å operere offshore på en miljøvennlig måte vil vi i dette prosjektet bruke DNA-basert overvåkingsteknologi for petroleumsnæringen. Prosjektet bærer innovasjon som kombinerer toppmoderne, miljøgenetiske teknikker med sanntidsovervåkning med nytteverdi for offshore industrien, myndighetene og forskere for å reagere raskere på miljø forurensing. Olje i vann fører til rask oppblomstring av noen spesifikke arter oljenedbrytende bakterier og slike endringer i sammensetning av bakteriesamfunn kan raske oppdages og brukes som et effektiv tidlig varslingsverktøy for oljeforurensning i det marine miljø. I dette prosjektet skal vi teste og utforske anvendelsen av en ubemannet sensorplattform, såkalt Environmental Sample Processor (ESP), til slik deteksjon. Fordi ESP?en kan utføre avanserte DNA-baserte sanntidsmålinger automatisk i havet, kan instrumentet i teorien overvåke endringer i spesifikke bakteriesamfunn og i så måte påvise olje forurensing. Vi har i et tidligere prosjekt identifisert bakteriearter som responderer på olje, og vi har testet at DNA-baserte protokoller i ESP?en kan oppdage og kvantifisere disse bakterieartene med PCR. I det nye prosjektet skal vi teste ESP?ens mulighet til å utføre nye målrettet gen identifikasjon for oljenedbrytende bakterier for å påvise olje i vann og utteste nyere moduler av ESP?en, slik som surface plasmon resonance (SPR) for å tilpasse til nyere versjon av instrumentet. Et sett med mikrobielle gener som er involvert i biologisk nedbrytning av olje er blitt identifisert i arbeidspakke 1 og 2, og disse er brukt videre i prosjektet for å utvikle spesifikke qPCR assayer. Dette settet med gener ble valgt ut basert på resultater fra metatranskriptomikk studier utført i dette prosjektet, samt fra litteraturstudier/søk i offentlige databaser. Alkan 1-monooksygenase (AlkB) er et enzym som finnes i mange typer bakterier og som er involvert i den bakterielle nedbrytningen av alkaner (en viktig komponent i olje) i naturen. Dette enzymet kodes for av alkB genet og et nytt sett med degenererte primere; alkB-deg, har blitt designet og optimalisert i dette arbeidet for å kunne detektere og kvantifisere flere ulike alkan-degraderende bakterier, som for eksempel SAR92 (som har vist seg å være signifikant oppregulert ved tilstedeværelse av olje) og andre kjent oljenedbrytende bakterier slik som Alcanivorax, Oleiphilus and Oleispira. Når det gjelder nedbrytning av polyaromatiske hydrokarboner (PAHer), har to nye genmarkører blitt identifisert og korresponderende degenererte primersett blitt designet; hpaD-deg and nahAc-deg, for å kunne detektere og kvantifisere ulike oljenedbrytende bakterier, som Colwelliaceae, Oceanospirillaceae (hpaD-deg) and Piscirickettsiaceae (Cycloclasticus) og Sphingomonadaceae (nahAc-deg). Fra labforsøk utført vinteren og sommeren 2018, konkluderer vi midlertidig at primersett ikke klarer å fange opp på en tilstrekkelig god måte de ulike bakterier som blomstrer opp som følger av olje i vann. Likeså ser det ut som at en direkte kvantifisering av Oleipsira er like bra enn å kvantifisere antall alkB gener, særlig i sommer situasjon og for lett rå olje. En ny ESP som er tilpasset bruk på en AUV (autonomt undervannsfartøy) er nå utviklet i USA og denne har flere nye egenskaper og med nyere moduler som surface plasmon resonans (SPR). WP3 har derfor fokusert på å tilpasse assay for et sett med oljedegraderende mikrobielle gener for bruk på SPR-enhet i den ny ESP?en. Dette arbeidet er blitt gjort sammen med en partner i Genomape-prosjektet fra Univ. Washington, Seattle (USA). Lovende resultater med SPR og en DNA-probe som skal identifisere og kvantifisere Oleispira antarctica har blitt oppnådd for korte sekvenser av O. antartica (45-nukleotider). En masteroppgave fra Universitet i Stavanger har blitt gjennomført for å teste oppsettet under laboratoriebetingelser og med protokoller kompatible med ESP. Så langt har vi greid å detektere kunstige O. antartica sekvenser, men så langt viser det seg å være ikke mulig med reelle O. antartica 16S rRNA sekvenser, noe som er utfordrende for videre bruk av teknologi. Etter en test med lab PCR utstyr og optimalisering av analysen for bruk på ESP ved NORCE, har DTU-Denmark nettopp fullført analysen av et utvalg feltrelevante sjøvannsprøver med ESP-teknologien i laboratoriet. Både gener spesifikke for Colwellia, Oleispira og Cycloclasticus (utviklet tidligere i. #215598), og funksjonelle gener AlkB og nahAc-deg ble brukt som mål i ESP. Dataene er under analyse. Samlet sett viser resultatene en ganske god respons fra de taksonomiske analysene på forurensningsnivå, mens AlkB og nahAc-deg respons på forurensning er mer variabel.

Det er viktig å sikre at petroleumsnæringen driver deres virksomhet på en miljømessig forsvarlig måte. Prosjektets viktigste leveranse har vært å demonstrere at en endring av olje-relatert mikrober kan fungere som et alternativ til å påvise olje lekkasje eller søle i vann, og at ESP-roboten faktisk kan gjøre dette i sanntid i felt. Dette gjelder særlig til mindre lekkasje der eksisterende teknologier feiler å påvise olje. Dessuten, man måler en faktisk konsekvens og mulig risiko for miljø når naturlige mikrobielle forekomster er endret forårsaket av olje i vann. Petroleumsnæring mangler system for å oppdage mindre akutt forurensning eller lekkasjer fra undervannsinnretninger på norsk sokkel, slik at raskt avbøtende tiltak for å minske risiko tas. PTIL har nylig gjennomført en tilsynskampanje r og det har ført til mye arbeid i næringen, og en oppdatering av NOROGs sin retningslinje 100. Erfaringen og teknologien brukte i dette prosjektet kan også være nyttig for denne prosessen videre.

Monitoring technologies are demanded for today's and future regulatory demands and society's acceptance to operate with care for the environment, particularly in sensitive marine areas. Novel solutions with devices capable of operating autonomously and in near-real time at sea like the Environmental Sampling Processor (ESP) exist. Here, this fully autonomous genosensor will be adapted. Protocols mimicking ESP operation will be used towards the detection of specific microbial genes involved in oil biodegradation as signatures of accidental oil occurrence at sea. To that goal, several research activities will be performed in the laboratory first then validated with ESP in situ. First identification of bacteria involved in degradation of particular oil fractions will be carried out. Then, information about highly abundant functional genes encoding enzymes involved in that degradation will be gained. Finally molecular assays targeting these genes will be designed (WP1).In WP2, the influence of environmental variables (presence of organic matter, seasons) and different oil types on bacterial gene assay performance and shift under exposure with oil will be evaluated to insure their robustness. As ESP trajectory development is progressing toward a third generation (3G-ESP) with new analytical modules like surface plasmon resonance (SPR), transfer of the gene assays on SPR will be conducted with adapted protocols for that module. Finally, WP 4 will demonstrate the full operability (from detection to communication) of the ESP deployed or used for Norwegian water to perform gene-based assays in situ. Proving that will be a significant step forward for the acceptance of this device as a tool for in situ surveillance by operators. This project will place Norwegian operators in a leading position regarding future environmental technologies and monitoring practices in the Norwegian Continental Shelf and will contribute significantly to their license to operate goal.