ANIHWA Bacteriophages as treatments of bovine mastitis caused by methicillin-resistant staphylococci (MRS) and staphylococcus aureus (MRSA)

Prosjektets overordnede mål var å studere om tidligere og nyisolerte bakteriefager har potensiale som terapisk eller profylaktisk behandling av jurinfeksjoner hos kyr (bovin mastitt) forårsaket av stafylokokker. Det er en generell økning i antibiotikaresistens, og generelt er høyt antibiotikakonsum forbundet med økt resistens hos bakterier. Bovin mastitt er en hyppig forekommende infeksjon i landbruket, og slike infeksjoner blir vanligvis behandlet med antibiotika. Den vanligste årsaken til bovin mastitt er stafylokokker, med Staphylococcus aureus som den viktigste. Et alternativ til antibiotikabehandlinger ved slike mastitter kan dermed redusere forbruket av antibiotika og derved redusere utviklingen eller spredningen av resistens. For å gjøre dette, må vi kjenne til egenskapene til stafylokokkene som er involvert, samt isolere bakteriofager og undersøke om de har ønsket effekt på stafylokokkene. I prosjektet har vi samlet 272 stafylokokker isolater, hvorav 100 er fra Norge og 172 fra Belgia. I alle bakterieisolatene kartla vi den fenotypiske resistensen og tilstedeværelsen av utvalgte virulensgener. Alle isolater ble identifisert til artsnivå. Isolering av nye bakteriofager viste seg å være betydelig mer utfordrende enn forventet. Ingen bakteriofager mot S. aureus ble påvist, men to bakteriofager mot Staphylococcus saprophyticus ble isolert. I mangel på bakteriofager mot S. aureus, det viktigste stafylokokkpatogenet ved bovin mastitt, brukte vi fire bakteriofager fra andre samlinger (mottatt fra andre institusjoner) i forsøkene. Etter innledende testing ble utvalgte S. aureus-isolater som viste følsomhet for bakteriofagene testet i to levende modeller. Galleria mellonella-larver inokulert med S. aureus ble behandlet med bakteriofager. Resultatet viste at selv om behandlingen med bakteriofager ikke påvirket dødeligheten, ble det observert en statistisk signifikant reduksjon av bakterier i larvene behandlet med fagene sammenlignet med de ikke-behandlede kontrollene. En av fagene ble videre testet mot et S. aureus isolat i en musemastittmodell. Også i denne studien ble det observert en statistisk signifikant reduksjon av bakterier i brystkjertlene, og en svakere betennelsesreaksjon ble observert. Resultatene viser at bakteriofager kan være aktive mot følsomme bakterieisolater også i vev. De to isolerte fagene mot S. saprophyticus ble isolert fra avløpsvannet i Paris, og genomene til disse ble sekvensert. Også genomene til 100 av stafylokokkisolatene ble sekvensert. Disse isolatene ble valgt på grunnlag av deres resistensmønster og virulensgenprofil. Sekvensene ble brukt til å studere slektskap, blant annet det genetiske grunnlaget for meticillinresistensen. Meticillinresistens overvåkes i humanmedisin over hele verden fordi den forbindes med multiresistens og dermed en uønsket utvikling. Sekvenseringen avslørte at resistensgener mot meticillin ble påvist også i isolater som testet negativt på andre metoder. Antimikrobiell multiresistens er fryktet fordi den hemmer antibiotikabehandling. Multiresistens (definert som resistens mot minst 3 antibiotikafamilier) ble påvist i 15% av S. aureus isolater. I tillegg hadde 94% av S. aureus isolatene minst tre virulensgener. Dette var ikke uventet, da isolatene var fra mastitt, og følgelig allerede hadde vist seg å være i stand til å forårsake infeksjoner (det vil si være virulente), og antagelig også har vært utsatt for antibiotikaeksponering via behandling av kua. I løpet av prosjektet har alle partnere samarbeidet og utvekslet vitenskapelig og metodologisk kunnskap og komptetanse. Fasiliteter ble stilt til rådighet og resultater og leveranser ble delt og flere møter, koordinatorbesøk og laboratorieutveksling ble organisert som forutsatt i prosjektet.

Prosjektet har bidratt til etablering og videreføring av internasjonalt samarbeid. En av partnerne (University of Liege) kjente vi fra tidligere samarbeid, men gjennom prosjektet er samarbeidet utvidet til å omfatte nye forskermiljø ved ytterligere to institusjoner. Prosjektet har gitt erfaring med nye metoder, som vi nå har tilgang til. Samarbeidet har vært raust, inkluderende og fruktbart, og alle partnere er interessert i å videreføre samarbeidet i nye prosjekter. Prosjektet har gitt samfunnseffekt i form av å opprettholde fokus på antibiotikaresistens i veterinærmedisin, og i tillegg har det bidratt til kompetansebygging innen temaet både hos oss og hos partnerne.

Antimicrobial treatment of mastitis has led to the selection of resistant staphylococci, among which the Methicillin Resistant S. aureus (MRSA) are the most frequently studied ones. Still, MR has also been described for non-S. aureus (NSA) species. Bovine veterinary MR(N)SA represent not only a problem in the treatment of mastitis, but also a potential hazard in public health via the inter-Staphylococcus transferability of the mobile genetic «Staphylococcal Cassette Chromosome» (SCC) that carry the mec gene(s) encoding MR and the zoonotic potential of some Staphylococcus species. The overall aim of this project is to study the potential of bacteriophages isolated from farm slurry and milk in different countries for the therapy or the prophylaxis of staphylococcal mastitis in cows, focusing more specifically on their potential activity against MR(N)SA. The potency of these phages as alternative to antimicrobial administration will be unravelled by: a) testing their lytic activity on bovine MR(N)SA isolated from cows with mastitis during in vitro growth (=lysotyping); (b) assessing their therapeutic or prophylactic activity compared to antimicrobials by conducting challenge experiments in mice. The project is divided into 4 workpackages. The main achievements will be: (i) assessment of the potential of phages as alternative therapy or prophylaxis of MR(N)S mammary gland infections and (ii) identification of the genetic criteria of identification of the most effective phages.