Combining FTIR-based Screening with Ligand Fishing Technologies for Facilitated Discovery of Antidiabetic Peptides in Protein Hydrolysates

Proteinhydrolysater fra sidestrømmer i matindustrien er verdifulle kilder til peptider for både ernæringsmessige og farmasøytiske formål. Hovedmålet for dette prosjektet er å utvikle metoder som muliggjør deteksjon og isolering av peptider med gunstige helseeffekter fra proteinrike sidestrømmer i matindustrien. Disse metodene baserer seg på (i) Fourier-transform infrarød spektroskopi (FTIR) for rask utvelgelse av potensielle hydrolysatkandidater, og (ii) avansert biokjemisk deteksjon ved hjelp av ligandbinding og høyoppløselige bioassays. I prosjektet PepFishing har ulike terapeutiske markører relatert til diabetes vært undersøkt. Både alfa-glukosidase, alfa-amylase, protein-tyrosin fosfatase1B (PTP-1B) og dipeptyl peptidase IV (DPP-IV) har vært brukt. Sistnevnte, som er et veletablert terapeutisk mål for regulering av blodsukkeret, viste seg å være det mest lovende målet for bioaktive peptider fra proteinhydrolysater. Gjennom vår omfattende screening, fant vi et proteinhydrolysat med en mulig antidiabetisk effekt. Dette hydrolysatet, som er utvunnet fra sidestrømmer fra kyllingproduksjon, har vist aktivitet mot enzymet DPP-IV. For å kunne identifisere peptidene som står for den observerte aktiviteten, har vi utviklet en avansert bioanalytisk metode; et kromatografikoblet bioassay. Metoden gjorde oss i stand til å identifisere nye peptider med potensielle positive effekter mot diabetes. Disse resultatene er sammenfattet i en forskningsartikkel som er publisert i tidsskriftet Food and Function. Videre har vi også undersøkt HMB-CoA reduktase som en mulig terapeutisk markør. Dette for å evaluere mulige kolesterolsenkende egenskaper hos peptider produsert fra sidestrømmer. De foreløpige resultatene viser at peptider produsert fra sidestrømmer i kyllingproduksjon kan inhibere HMG-CoA reduktase. Peptidene viser altså potensiale som mulige kolesteroldempende forbindelser. Screening for bioaktivitet med terapeutiske markører alfa-glukosidase, alfa-amylase og PTP-1B ga ikke positive utslag. En stor del av prosjektet har også omhandlet utviklingen av ligandbinding som en ny metode for å isolere bioaktive peptider. Vi har immobilisert angiotensin-converting enzyme (ACE) på magnetiske nanopartikler som et verktøy for å selektivt kunne skille ut blodtrykkssenkende peptider fra komplekse blandinger av proteinhydrolysater. En ny screeningmetode har blitt utviklet der magnetisk ligandbinding kombineres med høyoppløst inhibisjonsprofilering. Denne metoden er testet for alfa-glukosidase som er en diabetes type 2-markør, og resultatene er publisert i forskningsjournalen Talanta. I tillegg, har vi lyktes med å immobilisere enzymet DPP-IV på superparamagnetiske nanopartikler. Disse nanopartiklene med immobilisert DPP-IV viste seg å være svært effektive for å «fiske ut» antidiabetiske forbindelser fra en modellprøve (et tyttebærekstrakt). Dette studiet viser det første eksempelet på ligandbinding med en alkalisk protease og en vitenskapelig artikkel basert på dette arbeidet er publisert i tidsskriftet PLoS ONE. På tross av at utviklingen av selve ligandbindingsmetodene var vellykkede, har vi ikke lyktes med å bruke disse til å identifisere bioaktive peptider. Dette var i stor grad på grunn av manglende selektiv affinitet mellom enkeltpeptider og de immobiliserte enzymene. En midlertidig konklusjon er at ligandbindingsmetoder er bedre egnet for prøvematrikser som for eksempel polyfenoler, og at utfordringer relatert til manglende selektivitet må tas med i betraktning når disse metodene anvendes på peptidblandinger. Ett av delmålene i prosjektet var å utvikle FTIR-spektroskopi som et raskt screeningverktøy for bioaktive peptider. Vi har bygget opp et bibliotek med 120 forskjellige proteinhydrolysater produsert fra biprodukter av kylling med ulike prosessbetingelser. Alle disse hydrolysatene har vært screenet for tre bioaktiviteter: DPP-IV-inhibering, ACE-inhibering og antioksidantaktivitet. Vi har tatt opp FTIR-spektre for alle hydrolysatene som et «kjemisk fingeravtrykk». Disse dataene har så blitt kombinert for å bygge multivariate modeller som korrelerer de kjemiske fingeravtrykkene (altså FTIR-spektrene) med observert bioaktivitet. Disse modellene har vært nyttige verktøy for å gjøre begrunnede utvalg av proteinhydrolysater for videre studier samt i identifiseringsprosessen. Vi arbeider nå med et manuskript for å publisere disse resultatene. Et ytterligere datasett med kjemiske fingeravtrykk fra kromatografi og FTIR for 60 hydrolysater produsert fra melkeprotein har blitt produsert. Antioksidative egenskaper og hydrolysegrad ble korrelert mot kromatografi- og FTIR-dataene, og resultatene ble publisert i Food Chemistry. Alt i alt har vi lyktes med å utvikle flere avanserte bioanalytiske metoder for å kunne identifisere bioaktive forbindelser i komplekse blandinger. I tillegg har prosjektet vist at bioaktive peptider produsert fra sidestrømmer i matindustrien har stort potensiale som helsebringende ingredienser.

PepFishing has inspired a new Collaborative and Knowledge-building Project funded by the research council of Norway (NFR/320086). This project is based on findings in PepFishing related to bioactive peptides. Additionally, PepFishing enabled Nofima (the host institution) to strengthen its strategic initiative related to peptide (Peptec) and analytical (Spectec) technologies by adding an important dimension related to health. Findings in PepFishing have also laid the foundation for future development of high value ingredients (i.e., health promoting peptides) form underutilized by-products from the food industry. The project contributed significantly to the personal career development of the project manager through experience and building a track record. Among the positive consequences of this was the project manager have received 2 new grants (NFR/320086 and MAIBIT/UB0077) as a project managed and 1 new grant as a co-applicant (NFR/312136) related to the field of bioactive peptides.

Protein hydrolysates, produced from food processing byproducts through enzymatic hydrolysis, are invaluable sources of peptides with potential health promoting effect, including antidiabetic activity. However, inherent complexity of food processing byproducts and the chemical changes introduced through enzymatic hydrolysis poses a significant challenge in discovery of antidiabetic peptides. Therefore, a specialized technology for screening and identification of bioactive principles in protein hydrolysates is highly needed in product development. The current project aims at developing a bioanalytical platform combining: (i) Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy-based rapid screening and (ii) advanced biochemical detection technologies (i.e., ligand fishing and high-resolution bioassay) for facilitated identification of bioactive peptides in protein hydrolysates. This bioanalytical platform will be used to screen protein hydrolysate from poultry and dairy processing byproducts for potential antidiabetic peptides. Chicken carcasses both before and after mechanical de-boning as well as whey will be used as major sources of protein. Both whey and chicken protein hydrolysates have been associated with antidiabetic activities, hence there selection in the current project as relevant protein sources. A successful implementation of this technology will support both Norwegian and international biotech companies to achieve an efficient and high-quality screening program for bioactive constituents in complex food product. While collaboration with two Norwegian food processing industries (Tine and Norilia) provides access to wide range of byproducts, partnership with University of Copenhagen, Denmark and National Institute of Health, USA ensures internationalization.