Re-oxygenation resilience - the overlooked element of anoxic survival

Det er velkjent at karussen (Carassius carassius) har en unik evne til å overleve uten oksygen. Denne egenskapen utnyttes av fiskene om vinteren, når de små innsjøene de lever i får et tykt lag med is som begrenser tilførselen av oksygen fra luften til vannet, og dannelsen av oksygen fra vekster. Karussen tilpasser energibehovet til mengden av energi den kan produsere, og har en molekylær tilpasning som gjør at den kan omdanne melkesyre til alkohol, som den deretter kan bli av med over gjellene. Derfor kan den overleve lenger ved å bruke anaerob metabolisme, uten å akkumulere melkesyre som ellers ville forsuret blodet. Total oksygenmangel kan likevel forventes å forstyrre likevekten i mitokondriene (organellene som er ansvarlige for respirasjon og dannelsen av energi i form av ATP), og denne forstyrrelsen får cellen til å avgi et "dødssignal", som fører til at selve cellen dør. Ettersom karusellen overlever gjentatte perioder med anoksi og påfølgende re-oksygenering, må den ha egenskaper som gjør det mulig å reparere og kanskje til og med begrense skadeomfanget, noe som gjør den spesiell i forhold til de fleste andre dyr. Når man får blodpropp i hjernen eller hjertet, noe som rammer mange mennesker hvert år, fører mangel på blodtilførsel til mangel på oksygen, og når blodtilførselen er gjenopprettet, fører det til langvarig skade på vevet. I dette prosjektet ville vi undersøke hvilke prosesser som bidrar til karusellens evne til å overleve spesielt re-oksygenering, noe som det ikke tidligere har vært mye fokus på. Forståelsen vi kan få fra studier på karussen kan utvide vår forståelse av de fysiologiske mekanismene, en forståelse som til og med kan være nyttig i biomedisinsk forskning. I prosjektet har vi utviklet en protokoll for å undersøke de nukleotidsekvenser (mRNA) som vil bli oversatt til protein i cellene i forhold til hvor mye av mRNAet som finnes til en vis tid for et gen. Vi har identifisert flere gener som kan være interessante for videre forskning. For eksempel er det en kraftig økning i gener som koder for proteiner som regulerer aktiviteten av HIF (hypoxia inducible factor), en faktor som vanligvis aktiveres når det ikke er oksygen. Men aktiviteten til HIF er ikke nødvendigvis er en fordel hvis det ikke er noe oksygen å ta opp fra vannet i det hele tatt, og dette kan være forklaringen til at karussen forsøker regulere aktiviteten til HIF. Vi har også observert at genuttrykk av molekyler som binner oksygen, som for eksempel myoglobin, reduseres i hjernen. Dette er noe som må undersøkes videre, men man kan spekulere at det er fordelaktig å redusere mengden av myoglobin for at unngå en for rask økning i oksygen i cellene, noe som kan lede til dannelse av reaktive oksygenradikaler (ROS). Resultatene viser at utover at spesifikke gener blir slått av og på, og oversatt til protein, så kan dynamikken mellem genuttrykket og videre oversettelse til protein under anoksi og reoksygenering i seg selv endres, og dermed har en mekanistisk rolle for karussens evne til å overleve anoksi og reoksygenering. Med massespektrometri har vi målt metabolitter involvert i energiomsetning, så som ATP, suksinat og laktat i flere vev, og hvordan nivåene påvirkes av anoksi og reoksygenering. Resultatene viser at det stor forskjell på hvor fort endringer skjer, spesielt i reoksygenering, hvor hjertet virker til å gå langsommere tilbake til normale nivåer sammenliknet med hjernen. I tillegg virker det til at suksinat, som inne i mitokondriene er det molekyl som kan gi anledning til dannelse av ROS, fraktes fra forskjellige vev og ut i blodet. Vi spekulerer at dette tyder på at suksinat fraktes for eksempel til leveren som deretter omsetter det, eller muligvis at noe av suksinatet fraktes til gjellene og diffunderer ut i vannet. Begge dele kan være en mekanisme for å beskytte mere følsomme og kritiske organer som hjernen og hjertet. I tillegg til en mulig aktiv håndtering av suksinat som beskyttelse mot dannelse av ROS, har målinger på isolerte mitokondrier vist at karussen sammenliknet med den nær beslektede vanlige karpe (Cyprinus carpio), danner mindre ROS per molekyl som omsettes. Denne observasjon støttes også av at det ikke akkumuleres ROS eller er en økning av oksidativ skade i vevene i noen særlig grad under reoksygenering. Overordnet sett har prosjektet vist at karussen kan ha utviklet en rekke spesifikke og til nå ukjente mekanismer og tilpasninger for å håndtere reoksygenering. Gjennom å studere disse mekanismene nærmere kan vi få viten som ikke bare er viktig for den biologiske forståelse av anoksitoleranse, men også gi ideer som kan brukes i tverrfaglig forskning innenfor biomedisinsk forskning, ettersom både mangel på oksygen og reoksygenering er viktige faktorer i flere sjukdommer.

The information obtained in this project has furthered our understanding of one of the important models in comparative physiology - one of the few vertebrate animals that can survive without oxygen. The project has shown the power of using a multi-omics approach to discover important mechanisms that one cannot extrapolate from the pathological conditions induced by anoxia in mammals. The sequencing data will serve as a resource also for other researchers and for future work with the genome and evolutionary questions. The findings are particularly useful for further developing cross-disciplinary projects in collaboration with biomedical researchers, due to the role that lack of oxygen and reoxygenation plays in some diseases. The data will continue to inspire new questions, as further details are uncovered and followed up upon.

The ability of the crucian carp (Carassius carassius) to survive anoxia for several months makes this animal a unique model. This anoxia tolerance is gained by matching ATP demand with ATP production. Nevertheless, without oxygen, the respiratory chain may be at a full stop, resulting in mitochondrial depolarization - a death signal in other animals. Moreover, it is often overlooked that when oxygen is restored, free oxygen radicals are bound to be produced, damaging mitochondria and DNA. Indeed, preliminary data reveal an increased occurrence of apoptotic cells in the crucian carp brain after re-oxygenation, but not in anoxia. Thus, the crucian carp must posses effective repair mechanisms, as it evidently survives many years of repeated re-oxygenation episodes in nature. This makes crucian carp interesting even from a biomedical perspective, as reperfusion after the ischemia associated with stroke and heart attack can be as detrimental as the ischemia itself. Furthermore, recent analyses reveals that a large proportion of the crucian carp brain transcriptome is differentially regulated in anoxia and re-oxygenation, revealing very active molecular responses rather than shutting down and waiting for 'better times'. At the same time, post-transcriptional mechanisms may be at work to modulate or even dampen the transcriptional response. Using an array of methods, from real-time quantitative PCR and western blotting, to the recently developed ribosome footprint profiling, I will examine and identify the pathways that are keys to the re-oxygenation response. I will look at the damage of the brain in more detail, to determine if the processes are restricted to certain areas, and also look at different stages of recovery. Lastly, to be able to quantify the functional consequences of anoxia/re-oxygenation damage, I will investigate if increased cell death also occurs in the heart, another sensitive organ, and measure its effects on cardiac performance.