Methane oxidation by extremophilic Verrucomicrobia adapted to geothermal environments

Metanoksyderende bakterier, også kalt metanotrofer, oksyderer metan, en potent drivhusgass, som eneste karbon- og energikilde. En ny gruppe av varme- og syre-elskende (termoacidofile) metanotrofer tilhørende fylumet Verrucomicrobia er funnet i vulkanske miljø. Bakterier tilhørende dette fylumet er svært utbredt i naturen, men deres økologiske rolle og fysiologiske egenskaper er lite forstått. I dette prosjektet studerer vi metanotrofe Verrucomicrobia sine spesielle molekylære, fysiologiske og genetiske egenskaper for å finne ut hvordan metanoksydasjon foregår i ekstreme miljø og å øke vår kunnskap om biologisk metanoksydasjon generelt. Vi bruker sammenlignende genomanalyser for å undersøke slektskap mellom 8-9 ulike stammer isolert fra varme terrestriske kilder fra hele verden, noe som viser at de tilhører ulike men likevel nærbeslektede taksa. Videre viser analysene en stor forskjell i antall transposable elementer, og indikerer at denne forskjellen har vært en drivkraft for den genomdivergensen man ser mellom stammene. Vi har også brukt genomanalyser for å predikere fysiologiske egenskaper til disse organismene som vil bli verifisert eksperimentelt i laboratoriet. Termofile metanotrofe Verrucomicrobia innehar tre komplette sett av genene som koder for nøkkelenzym-komplekset, partikulær metan monooxygenase (Pmo), som katalyserer det første trinnet i metanoksydasjonsveien; oksydasjon av metan til metanol ved bruk av molekylært oksygen. Pmo genene er organisert i tre distinkte men differensielt uttrykte pmoCAB1,2 og 3 genklynger. Vi arbeider med å få en bedre forståelse av reguleringen av disse klyngene med målsetning om å forstå deres differensielle regulering og funksjoner. Det har blitt vist at pmoCAB1 og 2 er differensielt uttrykt under ulike oksygenkonsentrasjoner. Vi har identifisert et gen som koder for en mulig transkripsjonsregulator i nærheten av pmoCAB1 og 2 genene. Denne mulige regulatoren er blitt utrykt og renset, og brukes i biokjemiske metoder for å undersøke dets mulige rolle i reguleringen av transkripsjonen av pmoCAB1 og 2. Vi har fremstilt polyklonale antistoffer mot denne regulatoren og er i ferd med å utføre en ChIP-seq analyse for å identifisere bindingsseter for regulatoren på DNA. Det jobbes også med å kartlegge initieringsstedet for transkripsjon av pmoCAB1 og 2 ved hjelp av «primer extension», noe som vil gjøre det mulig å identifisere promotorområder og mulige regulatoriske sekvenssignaler for binding av regulerende proteiner. Disse to tilnærmingene vil kaste lys over reguleringsmekanismen for ekspresjon av pmoCAB1/2. I 2021 ble det rapportert av en Koreansk gruppe at metanotrofe Verrucomicrobia kunne vokse på C3-forbindelser som 2-propanol, aceton og acetol, og at pmoCAB3 klusteret var sterkt uttrykt under disse vekstbetingelsene. Dette indikerer at pmoCAB3 er involvert I oksydasjon av C3 forbindelser heller enn metan. Alle våre stammer viste seg også å vokse på disse C3-forbindelsene, som støtter disse observasjonene. Det finnes enda ikke genetiske analyseverktøy for metanotrofe Verrucomicrobia. Forsøk på transformasjon ved bruk av ulike plasmidvektorer og transformasjonsprosedyrer har ikke lykkes. Det pågår et samarbeid med Amy Rosenzweig sin lab ved Northwestern University, Illinois, USA, med sikte på å løse krystallstrukturer for Pmo enzymer. Dette er viktig for å kunne forstå de biokjemiske egenskapene og reaksjonsmekanismen, spesielt rollen til metallioner i det katalytiske setet. I samarbeid med NORCE i Stavanger har vi opparbeidet biomasse som er sendt til den Amerikanske partneren for rensing og forsøk på krystallisering av Pmo. Dette arbeidet er tidkrevende og vanskelig, men utleding av krystallstrukturen til dette membranproteinet vil gi oss verdifull informasjon om forskjeller og likheter av struktur/funksjons-forhold i Pmo fra proteobakterier og verrukomikrobier og om opprinnelsen og evolusjonen til dette nøkkelenzymet. Vi har seks nye isolater av metanotrofe verrukomikrobier fra geotermale miljø på Island, Azorene, Yellowstone National Park og Filippinene. Sammenligning av disse stammene har lært oss at evolusjonen av disse organismene for en stor grad drives av geografisk isolasjon (allopatrisk evolusjon), noe som er sjelden for prokaryoter. De nye isolatene inkluderer to nye arter, som begge er fullstendig genomsekvensert vha. Pacbio-teknologi og sammenlignes nå med bioinformatiske metoder og et manuskript er under utarbeidelse. Det er interessant at den ene stammen mangler en fullstendig pmoCAB1 genklynge. Fra tidligere har vi fullstendig genomsekvens for stammen Kam1. Resultater fra prosjektet gir ny innsikt i evolusjonen, diversiteten og biokjemien av biologisk metanoksydasjon, en antatt urgammel metabolisme og nøkkelprosess for å balansere den naturlige drivhusgassutviklingen så vel som å forbedre den bioteknologiske plattformen for industriell biotransformasjon av naturgass til mer høyverdige produkter.

Outcomes: Main outcomes are enhanced understanding of the diversity and molecular features of methanotrophic Verrucomicrobia. Competence in large-scale cultivation of gas-utilizing microbes in fermenters and bioinformatics-based genome analyses have been strengthened. A technological platform for use of these microbes for production of high-value products from natural gas has been created. Impacts: The project has contributed to an improved overall understanding of the role of methanotrophs in the carbon cycle with special focus on the greenhouse gas, methane, and how the oxidation of this greenhouse gas is regulated by methanotrophic communities in geothermal environments. It has also strengthened the collaboration between UiB and NORCE on gas fermentation as well as with The Northwestern University, USA. The awareness of the role of methanotrophs as a methane sink in curbing of the methane release to the atmosphere has been strengthened.

Methane-oxidizing bacteria, or methanotrophs, share the unique ability to use methane, a potent greenhouse gas, as sole carbon and energy source. A novel group of thermoacidophilic methanotrophs belonging to the Verrucomicrobia phylum and provisionally given the candidate genus name, Methylacidiphilum, has been found in acidic volcanic environments. These organisms, in particular strain Kam1, which was isolated in Birkelands lab from a hot spring in Kamchatka, will be used for further molecular, physiological and genetic analyses. Methanotrophic Verrucomicrobia possess three complete sets of the genes encoding the complex key enzyme, particulate methane monooxygenase, organized into three distinct but differentially expressed pmoCAB operons. We will further assess the differential expression of these operons with the aim to identify the functions and regulation of the various pmo clusters and the properties of their encoded proteins. In vivo transcription patterns will be further assessed, and transcription initiation sites mapped in search for regulatory elements. We further aim to develop genetic tools to assess the functional differentiation of these gene clusters using a gene inactivation approach. Both native Pmo and recombinant subunits and domains will be analysed structurally and biochemically, in particular to assess the role of metal ions in the catalytic mechanism. Novel isolates, recently recovered from geothermal regions worldwide, will be subjected to complete genome sequence analysis and phenotypic characterisation in order to assess their possible biogeographic structure and evolutionary relatedness. Results from this project will provide novel insights into the evolution, diversity and biochemistry of biological methane oxidation, a presumed ancient metabolic trait and key process in curbing natural greenhouse gas emissions, as well as improve the biotechnological platform for industrial biotransformation of natural gas to added-value products.