Exploring leucines role in feed intake and growth under stress: from sensing to action

Målsetningen med LeuSENSE-prosjektet var å undersøke mulige effekter av leucin-anrikede dietter på robusthet, velferd og vekst hos Atlantisk laks oppdrettet under normale og stressede forhold. Hypotesen er basert på pilotstudier som indikerte at den essensielle aminosyren leucin, når den ble tilsatt over anbefalte nivåer i laksefôret, kunne ha gunstige effekter på fiskens appetitt, muskelvekst, fettdeponering og motstandsdyktighet mot stress. For å teste hypotesen, etablerte vi først en standardisert protokoll for å stresse fisken. Tre forskjellige stressfaktorer ble testet (jaging, hypoksi og en kombinasjon av jaging og hypoksi) ved gjentatt eksponering i åtte dager. Alle de tre stressfaktorene førte til lavere vektøkning og veksthastighet enn ustresset kontroll. I tillegg fant vi endringer i kortisol-, laktat-, glukose- og kreatininnivåer i blod. Videre, viste mRNA-nivåene av kortikotrofin-frigivende faktor (crf), som har en rolle i stressrespons gjennom hypotalamus-hypofyse-interrenal (HPI) aksen, et lignende mønster til kortisol, dvs. høyere nivåer i telencefalon og hypothalamus i de stressede gruppene sammenlignet med gruppen som ikke er stresset. Basert på alle analyserte parametere, ble jaging vist å være den mest effektive metoden, siden den induserte tydeligere stressrespons. I løpet av prosjektet etablerte vi også nye kvantitative PCR (qPCR) analyser for å evaluere endringer i mRNA-uttrykket for faktorer som er involvert i responsen til stress og appetittkontroll. Dette gjaldt ulike crf-gener, og nevropeptidene agouti-relatert peptid (agrp), neuropeptid Y (npy), proopiomelanocortin (pomc) og kokain og amfetamin regulert transkripsjon (cart), samt reseptoren som integrerer disse signalene, melancortin -4 reseptor (mc4r) ble validert. Vi har også etablert en cellebasert analyse for å beskrive potensialet til hvordan L-leucin, og andre aminosyrer, kan stimulere signalveier som kan påvirke både fordøyelse og appetittkontroll. Resultatene indikerer at L-leucin stimulerer en kalsiumfølsom reseptor gjennom ERK-signalveien i nærvær av kalsium. L-leucin ser også ut til å stimulere frigjøring av tarmhormonet cholecystokinin i laksens tarm. I tillegg har vi også identifisert og etablert qPCR-analyser av transportmolekyler for aminosyrer (SLC7- og SLC38-familie), som er kjent for å være nøkkelregulatorer for mengden av leucin inne i cellen. For å se om tilskudd av L-leucin i fôret demper effekten av kronisk stress, ble fire L-leucin anrikede dietter gitt til Atlantisk laks oppdrettet under normale (optimale) eller stressede (suboptimale) forhold. Fôrinntak, vekst og genuttrykket av nøkkelgener involvert i appetittkontroll, vekst, energifordeling og HPI-stressakse ble analysert. Resultatene viste at stresset fisk spiste mindre fôr og vokste mindre enn kontrollfisken, uavhengig av fôrkilden. I tillegg gav økt tilskudd av leucin kun mindre endringer i mengde leucinnivå i fisken og i utrykk av gener involvert i regulering av fettbalansen (ppara), muskeldannelse (murf), stressaksen (crf), appetittkontroll (pomca) og transportmolekyler for aminosyrer i SLC-familien (slc7a5 og slc38a). Oppsummert fant vi at økt nivå av L-leucin ikke påvirket laksens motstandsdyktighet mot stress, og hverken protein-tilvekst eller vektøkning ble påvirket av leucin-nivå. Det gjenstår imidlertid å undersøke om leucintilskudd har en positiv effekt på fettakkumulering og metabolisme eller oksidasjon i laks med høyt fettinnhold, slik det er vist for andre arter. Også de dynamiske metabolske effektene rett etter fôring med leucin-anriket fôr bør undersøkes nærmere.

The LeuSENSE project investigated the effects of increased levels of dietary L-leucine in Atlantic salmon subject to stress. We have, therefore, established an effective protocol to induce stress in salmon and validated several stress-response markers, notably the identification of 4 corticotrophin-releasing factor genes and validation of gene-specific mRNA expression analyses (qPCR). Several qPCR assays were also established for key genes involved in the appetite control and are now routinely in use in our lab. Overall, the project results suggest that L-leucine supplementation did not improve salmon resilience to stress, which opens new research questions related to the role of leucine in salmon. The project also contributed to establish an in-vitro method to screen for functional response of amino acids and feed ingredients. The LeuSENSE was important in the academic education of two master students, and 3 PhD students that were also partially involved in the project.

LeuSENSE aims to assess if dietary leucine boosts robustness, welfare and growth in Atlantic salmon under stressful conditions. The project builds on our preliminary data and literature, indicating that certain amino acids, particularly leucine, have important positive effects above their nutritional requirement levels under allostatic conditions. During the normal production cycle salmon may encounter episodes of stress related to disease, changes in environmental conditions (temperature, salinity), handling, etc. We propose that a diet rich in leucine will reduce the physiological strain and result in more robust fish with improved lean growth (fillet) with less allocation of fat, and reduced time of production. Therefore, we will investigate how dietary leucine regulates daily feed intake and affects the overall metabolism including muscle growth and fat deposition in salmon reared under normal and stressed conditions. To this end we will combine in vivo, ex vivo and in vitro experiments, and analyse the gene expression profiling in candidate tissues to uncover which processes are vital in the metabolic processes from feed to muscle growth under allostatic conditions. This project will describe how leucine activates specific nutrient sensing receptors in the gastrointestinal tract and triggers gut-brain signalling pathways related to appetite, growth and health. Signals emerging in the gut receive a lot of attention in human nutrition, but virtually nothing is known in fish. LeuSENSE will provide novel information about leucine's role in these signalling pathways and in the metabolism of a teleost and apply the project results into tailoring improved feed for Atlantic salmon under suboptimal conditions.