Synthetic biology and rational virus attenuation - a study on Salmonid pancreas disease virus

Prosjektet ble innledet med å designe en smittsom (infeksiøs) klon av et SAV-isolat (SAV subtype 3) som hadde blitt innsamlet fra en laks med pankreassykdom (PD). Denne klonen er i det følgende kalt 'vildtype-SAV3'. Vildtype-SAV3 ble deretter fremstilt (syntetisert) som et DNA-plasmid og så brukt til å 'smitte' fiskecellelinjer. Overraskende førte ikke dette forsøket på smitte med DNA-plasmidet til produksjon av levende virus. Ettersom det var rimelig grunn til å forvente at plasmidet ville være smittsom, indikerte fraværet av virusproduksjon, at noe var galt. Da fiskecellelinjer generelt varierer mht. hvor 'godt' de lar seg smitte med SAV3 gjentok vi denne tilnærmingen med bruk av flere fiskecellelinjer, men resultatene forble negative.For å bøte på denne manglende evne til å smitte, 'reparerte' vi derfor vildtype-SAV3-klonen ved å skifte deler av sekvensen ut med DNA fra et annet SAV3-isolat fra PD-syk fisk. Vi oppdaget under prosessen 11 små forskjeller (mutasjoner) mellom virus-isolatene og kunne vise at endring av en bestemt av disse bragte 'vildtype-SAV3'-klonen til live. Parallelt med det ovennevnte, begynte vi et omfattende arbeid med å lage svekkete virusvarianter, dvs. virus som ville ha nedsatt virulens (evne til å fremkalle infeksjon og sykdom). Prinsippet var å introdusere endringer i virusets arvestoff (genomisk RNA-sekvens) som enten ville dempe virusets evne til å formere seg eller ville gjøre at viruset tidligere og mer effektivt ville bli gjenkjent fiskens immunsystem. Et viktig moment ved disse endringer var at de ikke førte til endringer av virusets proteiner ? man sier at endringene i arvestoffet er synonyme fordi de ikke endrer sekvensen av aminosyrer (proteiners byggesteiner) i virusproteinene. Ettersom effekten av hver av disse synonyme endringene er beskjedne, gjorde vi fra hundrevis til tusenvis av endringer i virusets RNA-sekvens. Til sammenligning har arvestoffet til SAV3 en RNA-sekvens på omtrent 11900 nukleotider (byggesteiner i RNA), hvilket illustrerer hvor omfattende endringer vi gjorde for å bygge de svekkete variantene.Praktisk var det første steg å bestemme 6 områder i RNA-sekvensen som sannsynligvis kunne endres uten å ødelegge andre viktige egenskaper og funksjoner ved sekvensen. Dernest å introdusere endringer i områdene ? endringer som ville føre til at arvestoffet ville få enten en annen såkalt 'codon-pair bias' eller økt innslag av såkalte 'CpG/UpA dinukleotider'. Hypotesen var at tilstrekkelig endring i codon-pair bias ville føre til at viruset fikk nedsatt evne til å formere seg i cellene, og at økt innslag av CpG/UpA ville føre til at viruset ble gjenkjent og bekjempet mer effektivt av fiskens immunsystem. Prosessen med å planlegge hvilke endringer som skulle gjøres var meget omfattende og krevde spesialisert programvare og betydelig manuelt etterarbeid. Som ovenfor for vildtype-SAV3, fremstilte vi et plasmid med en ny virusvariant med omfattende (codon-pair bias) endringer i alle de 6 områder av RNA-sekvensen. Denne er heretter kallet 'fullsvekket-SAV3'. Ved bruk av kloning fremstilte vi så kombinasjoner av vildtype-SAV3 og 'fullsvekket-SAV3' dvs. nye varianter som hadde endringene i henholdsvis 1, 2, 3 eller flere av områdene eller i ulike kombinasjoner av områder. Med dette ønsket vi å fremstille virusvarianter som var svekket i ulik grad. For å bestemme graden av oppnådd svekkelse, smittet vi deretter fiskecellelinjer med virusvariantene vi hadde fremstilt. Mens vildtype-SAV3 og de minst endrete variantene var like virulente som 'riktig' SAV3 fra en syk fisk, så vi gradvis økt svekkelse med økt mengde endring ? helt frem til total svekkelse ved de mest omfattende endringer. Dette oppfattet vi som et meget lovende resultat. Mens fiskecellelinjer er en uhyre nyttig modell for (bl.a.) studier av virus, gir de ikke nødvendigvis et fullgodt bilde av virusinfeksjoner i levende fisk. Neste steg i vår evaluering av den oppnådde svekkelse av virus var derfor smitteforsøk. I et forsøk utført ved Havforskningsinstituttet i Bergen fikk lakseyngel på 0.5 g injisert fire ulike virusvarianter inn i bukhulen. Resultatene fra forsøket er fortsatt under analyse, men de ulikt svekkede virusene resulterte i meget forskjellig dødelighet. Vildtype-SAV3 ga 100% dødelighet, den minst svekkede varianten ga knapt 60% dødelighet, mens de to mest svekkede variantene ga henholdsvis 1.7% og 0% dødelighet. Dette resultatet bekrefter at vi kan svekke SAV3 ved å endre codon-pair bias og at vi kan dosere denne svekkelsen. For å teste om infeksjon med de svekkede virusene kunne føre til utvikling av immunitet og beskyttelse mot smitte med fullvirulent SAV3, ble fisk smittet med vildtype-SAV3, 14 uker etter at de hadde fått 'vaksinasjon' med de helt eller delvis svekkede variantene. Uvaksinert fisk opplevde 25% dødelighet i dette forsøket, mens ingen av de vaksinerte fisk døde. Dette bekrefter det potensiale som ligger i å anvende slike/slikt svekkede virus varianter som vaksine mot PD.

We designed a Salmon alphavirus virus subtype 3 (SAV3) that is attenuated in salmon. Participants in this project have gained experience in synthetic biology and the design of potential virus vaccines. Research programs other than ours have benefited from the work conducted in this project by including our findings in their research programs. The project has also benefited our partners in France and South Africa, and further cemented our collaboration due to the synergy of our work. The sustainability of salmon aquaculture necessitates good fish health, and this will have welfare as well as economic benefits. The attenuated SAV3 can be used as research tools to study the immune system of salmon, so as to ultimately improve fish health. However, our use of synthetic biology may be controversial to members of society. We expect the scientific knowledge gained in this research to contribute to daily discussion of how our society should engage with advances in biotechnology.

The SYBIATT project is based on the hypothesis that a live variant of SPDV will be attenuated by changing either its codon-pair bias, CpG content, or codon:anticodon pairing energy, and that such a variant will still elicit a protective antibody and cellular immune response in salmon. The long-term goal is to use this live-attenuated SPDV and systems biology to study in greater detail the dynamics of complex immune interaction networks in salmon that are protected from PD. The project activities fall into four main parts: - First, attenuated variants of SPDV will be designed using three different strategies and subsequently synthesised as infective clones. The design will be done in close collaboration with Dr Darren Martin (UCT). - Second, the performance of the infective clones (variants) will be tested, e.g. for their infectivity, attenuation and genetic stability. This work will be done in collaboration with Prof Bremont and Dr Biacchesi (INRA), partly in France. - Third, the variants will be applied for (in-vivo) studies of virus-host interactions, development of immunity, genetic stability etc. Prof Bremont and Dr Biacchesi (INRA) and Dr Sundaram (NSC) will be closely collaborating and some of the studies will be done in France. - Fourth, systems biological software tools and approaches will be applied to explore and interpret RNAseq data from above studies. This work will be done in close collaboration with Dr Sundaram (NSC). The SYBIATT project will be an integrated part of the on-going MucoPath project at NVI. In context of MucoPath and in collaboration with Prof Bremont and Dr Biacchesi, Drs Monjane and Grove have designed and synthesised the first SPDV variants and are currently initiating the testing of these. While this preliminary work indeed supports the feasibility of the current project, SYBIATT will be a most vital extension and strengthening that will help the on-going activities to reach their final goal.