ISA resistance in Atlantic salmon: Defining new phenotypes for accurate breeding (iSABreed)

Infeksiøs laksanemi (ILA) er en virusinfeksjonssykdom med potensiell stor økonomisk tyngde for den norske laksebransjen. Dette er en sykdom som skadet lakseoppdrettsindustrien i Færøyene og i Chile hardt i henholdsvis 2003 og 2008, og er en stor bekymring også i Norge, da lakseoppdrettere de siste årene har opplevd en betydelig økning i antall utbrudd lange hele kysten. I dette prosjektet kombinerer vi genomisk informasjon med nye metoder for å oppdage og kvantifisere virus og immunrespons i hjerte og slim fra hud for å utvikle nye fenotyper for ILA-robusthet. Dette vil forbedre dagens praksis for å identifisere og velge de beste avlskandidatene og øke kunnskapen om fiskens immunsystem mot denne sykdommen. I 2018 ble det gjennomført smitteforsøk, som ble repetert i 2019, med 2000 fisk fra 15 familier. I tillegg til å registrere overlevelse, ble det tatt vevsprøver av hjerte fra fisk som overlevde forsøket og slimprøver fra skinn av tilfeldige fisk 3 og 6 dager etter smitte, samt fra fisk som overlevde forsøket. En tredel av fisken i forsøket var vaksinert mot ILA. Prøver av slim og hjerte er analysert med PCR for å beregne genetisk variasjon for mengde virus i disse vevene. I tillegg er slimprøver fra før og etter smitte, fra vaksinert og uvaksinert fisk, analysert for å studere immunrespons. All fisk i forsøket ble genotypet. Genetisk analyse avdekket signifikant genetisk variasjon for overlevelse og virusmengde i hjerte hos uvaksinert fisk. Genetisk korrelasjon mellom de ulike målene på resistens var høy hos uvaksinert fisk, men lavere hos vaksinert fisk. Korrelasjon mellom samme egenskap hos vaksinert og uvaksinert fisk var lav, noe som indikerer at det ikke er de samme genene som påvirker resistens hos vaksinert og uvaksinert fisk. Det ble også gjennomført assosiasjons-studier for å identifisere enkeltgener med stor betydning, men ingen signifikante gener ble funnet. Metodikk for analyse av metabolitter i mukus (metabolomics) har blitt etablert og optimert, herunder har et nyt kit (AbsoluteIDQ p400 HR, Biocrates, Østerrike) for såkalt targeted analyse av 408 metabolitter blitt implementert. Slimprøvene fra 2018-forsøket har blitt analysert for deres innhold av metabolitter, dels med en ?targeted? metode og dels med to ?untargetede? metoder (normal og revers fase kromatografi koplet til høytoppløsende massespektrometri). Resultatene fra den targetede analysen viser at carnitin og acylcarnitiner kan være (en) metabolitt-markør(er) som skiller mellom de eksperimentell gruppene. Massespektrometrisk analyse av proteomet i slimprøver illustrerte at rutinene for håndtering av prøver fra smittetester hos laks må forbedres. Som et resultat har nye metoder for rensing av prøver blitt testet. Immunologisk metodikk for analyse an ILA-spesifikke antistoffer i blod- og slimprøver har blitt (videre-) utviklet. ELISA-metodikk fra litteraturen viste seg å gi betydelig bakgrunnsstøy og det har derfor blitt utviklet en vesentlig optimalisert metode basert på fraksjoner av opprenset virus-protein. Utvikling av en tilsvarende immunologisk metode som anvender fluorescerende kuler og BioPlex instrumentering er igangsatt. Denne metoden forventes å øke sensitiviteten og dermed underlette analyse av slimprøver. Vi bruker RNA-sekvensering til å identifisere molekylære profiler som kan brukes som nye fenotyper når vi selekterer for ILA resistens. Dette ble gjort ved først å sammenligne genekspresjonsprofiler til resistent fisk med tilsvarende profil for mottagelig fisk. Sammenligningen ble gjort basert på ekspresjon av tusenvis av gener som var uttrykt i hjerte og i slim. Det første viktige funnet er at mottagelig fisk sprer mer virus til omgivelsene. Dette funnet har betydning for dyrevelferd og for å redusere antall ILA utbrudd. Videre fant vi at uansett om hjerte eller slim ble analysert var det en tydelig forskjell på resistent og mottagelig fisk i ekspresjonsmønster. Vi valgte ut noen av disse markørene og utviklet tester for dem som ble brukt til å teste flere fisk fra smittetestene. Disse testene differensierte tydelig mellom resistente og mottagelige fisk. Testen har også blitt validert på flere hundre fisk fra et feltutbrudd som bekreftet at de kan brukes til å skille resistent og mottagelig fisk fra hverandre. I 2019 ble det gjennomført et epidemiologi-forsøk der naiv fisk ble fordelt på 18 ulike kar som ble smittet av fisk med ulik genetisk motstand mot ILA for å studere sammenhengen mellom resistens og infektivitet. Vi fant at både vaksine og seleksjon for redusert dødelighet reduserte smittespredningen, men ingen av disse gjorde at fisken ikke smittet i hele tatt. Seleksjon virket mer effektivt en vaksine for å redusere hvor smitteførende fisken er, men forskjellen mellom disse var ikke statistisk signifikant.

The project has provided new insight into immune responses and infectivity of ISAV infection and identified useful biomarkers for existing and new resistance traits. Benchmark Genetics has already implemented some of the key findings of this study in their breeding program. In particular, by utilising the developed assays, they are now screening the immune response of fish following ISAV infection.

Infectious diseases continue to pose major problems for aquaculture in Norway, resulting in large economic losses and negatively impacting animal welfare and their living habitats. Selective breeding to enhance pathogen resistance has been a successful strategy, although for some diseases, such as chronic or subclinical infections, the best selection criteria or phenotypes are yet to be defined. Recent developments of various genomic resources in Atlantic salmon has now provided us with the opportunity to exploit these advances to both improve our understanding of the underlying genetic basis of disease resistance, and to provide tools to more accurately and efficiently select them in breeding programs. In this application, using a multidisciplinary approach, we aim to use these advances to complement and enhance the current practices for identifying and selecting the best candidates while breeding against infectious salmon anaemia, a deadly contagious disease of farmed Atlantic salmon. We expect selection based on the newly defined phenotype(s) and the tools and methodologies that will be developed for measuring them, to provide the supporting industry partner, SalmoBreed, with a highly valued product and the underlying idea to further be applied to many other diseases of economic importance.