NUTRINFECT: New in vitro assays of fish pathogen infection across the intestinal epithelium and effects of functional feed ingredients

Innen akvakultur er sammenhengen mellom ernæring, immunresponser og produksjonssykdommer uklar. Kunnskap om hvordan fôrkomponenter kan påvirke slimhinne-infeksjoner er fortsatt ukjent, ikke minst på grunn av mangel på målrettede forskningsverktøy. In vitro-modeller kan med fordel brukes som målrettede verktøy for å studere celle- og vevs-spesifikke funksjoner og som kartleggingssystem for å teste nye fôringredienser, før kun de mest gunstige kandidater benyttes til videre forsøk med levende fisk. Sammenliknet med tradisjonelle fôringsforsøk som både krever høyt antall forsøksdyr og er kostbare å gjennomføre, er in vitro-modeller kostnadseffektive alternativer som er enkle å utføre. Målet med postdoktor-prosjektet NUTRINFECT var å etablere nye in vitro-metoder for å evaluere effekter av fiskefôr-ingredienser på infeksjonssykdommer og tarmhelse hos laksefisk. Ettersom patogener inkludert virus primært entrer fisken via slimhinner i tarm, gjeller og hud, ønsket vi å etablere smittemodeller med viktige virus fra laksenæringen ved å benytte en tilgjengelig tarmcellelinje fra regnbueørret (RTgutGC). Ved å dyrke tarmcellene på en porøs membran i et to-kammer-brønnsystem dannes en sammenhengende men gjennomtrengelig barriere som simulerer epitelet i tarmen. Første delmål i prosjektet var å undersøke smitte med infeksiøs pankreas nekrose virus (IPNV), salmonid alfavirus 3 (SAV3) og infeksiøs lakseanemi virus (ILAV), som er tre alvorlige virus innen lakseoppdrett, i tarmcellelinjen. Andre delmål var å optimalisere det simulerte tarmmiljøet, og derfor behandle RTgutGC-cellelinjen med galle fra regnbueørret og syntetisk gallesalt ettersom galle har vist seg å ha stor betydning for utviklingen av tarmepitelet og dets funksjoner. IPNV, SAV3 og ILAV smittet og replikerte i tarmcellelinjen RTgutGC fra regnbueørret. De tre virusene hadde for øvrig ulikt infeksjonsforløp og gav ulik respons i cellene. Ved smitte med IPNV inntraff cytopatogen effekt (CPE) raskt (dag1-2), det vil si at cellene endres strukturelt på grunn av viruset, og infeksjonen forløp raskt med full CPE (cellene helt ødelagt) innen ca. 1 uke. Økt infeksjonsdose med IPNV gav tidligere CPE, økt virusreplikasjon i cellene og økt immunrespons. For SAV3 var CPE noe senere (dag4) og ikke like fremtredende, og infeksjonen vedvarte lenger med full CPE oppnådd etter ca. to uker. Også for SAV3 gav økt dose tidligere CPE og økt virusreplikasjon i cellene. Derimot cellulær anti-virale respons mot SAV3 var signifikant redusert med økt dose, hvilket kan tyde på at SAV3 hindrer cellenes responser. For ILAV ble CPE observert ved dag4 og full CPE nådd ved ca. dag10 ved lav dose (moi=0,1), mens økt dose (moi=10) forsinket CPE. Lav dose gav høy virusreplikasjon i cellene, mens virusreplikasjon ved høy dose ikke var signifikant ulik fra kontrollceller. Den cellulære immunresponsen mot ILAV var høy, og tilsvarende lik hverandre, ved både lav og høy infeksjonsdose for flere av de undersøkte genene. Det betyr at ILAV trigget vertsresponser hos RTgutGC-cellene både når viruset replikerte i cellene, men også når viruset kun var til stede i vekstmediet uten at cellene var infisert. Tarmbarrieren ble signifikant påvirket av virusinfeksjon med alle tre virus allerede 22 timer etter smitte, ved at permeabiliteten av barrieren økte. Denne in vitro-modellen kan derfor brukes videre for å undersøke effekter av fôrkomponenter på smitte med IPNV, SAV3 og ILAV i tarm hos laksefisk. Gallesalter er til stede i høyt nivå i tarmen hos levende fisk, men hvilken betydning disse har for funksjonaliteten av tarmcellene utover opptak av fett er lite undersøkt. Hos laksefisk er >90% av gallesaltene taurokolat. Genekspresjonsanalyser viste at behandling av RTgutGC-cellene med galle, enten tatt fra galleblæren hos regnbueørret eller som ren taurokolat, endret signifikant tarmcellenes metabolisme og funksjonalitet uten at cellene levedyktighet ble negativt påvirket. Høye nivåer av galle (>0.5 mg/mL) var imidlertid toksisk for cellene. RNA-sekvenseringsanalyser viste at fire dagers behandling med gallesalter tydelig endret transkriptomet hos RTgutGC-cellene. Det var særlig gener relatert til lipidmetabolisme, retinolsyre-metabolisme (knyttet til vitamin A-funksjon), immunfunksjoner og transport som var påvirket. Mer målrettede qPCR analyser viste at cellenes barrierefunksjon og mikrovilli-enzymer var påvirket, hvilket indikerer at galle har funksjon for modning av tarmcellene. Gallesalter bør derfor inkluderes i vekstmediet til tarmceller ved in vitro-studier av tarmcellefunksjoner for å bedre simulere tarmmiljøet i levende fisk. Behandling med total galle og ren taurokolat gav imidlertid noe forskjellige effekter, og det var den rene taurokolaten som gav tydeligst respons hos RTgutGC-cellene. Dette kan tyde på at det er andre komponenter i den totale gallen som også innvirker og modulerer effekten utover taurokolaten i gallen. Effekter av ulike gallekomponentene på tarmcellene bør undersøkes videre.

Prosjektet har resultert i at vi har etablert in vitro smittemodeller med viktige laksevirus i en tarmcellelinje fra regnbueørret. Disse smittemodellene vil brukes videre av vår forskningsgruppe for å undersøke effekter av nye fôringredienser for infeksjonssykdommer og tarmhelse hos laksefisk. Vi har allerede pågående prosjekter hvor vi drar nytte av denne kunnskapen (blant annet EU Horizon 2020-prosjekt) og vi vil søke nye prosjekter for å bygge videre på det som ble etablert i postdok-prosjektet. Videre har prosjektet ført til at vi har endret vekstvilkårene for tarmceller in vitro ved å tilsette gallesalter for å bedre mimikere det naturlige miljøet i laksetarm, ettersom gallen hadde signifikant betydning for tarmcellenes utvikling og modning. Denne kunnskapen er allerede direkte tatt i bruk i andre pågående prosjekter. Prosjektet har videre ført til at postdok-stipendiaten har tilegnet seg betydelig økt kompetanse blant annet innen områdene cellekultur, infeksjonsbiologi og gallemetabolisme, samt erfaring i prosjektledelse. Postdok-stipendiaten vil derfor, inn i sin neste stilling, være en økt ressurs for forskningsgruppen. Resultatene fra dette postdok-arbeidet vil kunne forenkle fremtidig evaluering av stadig mer komplekse fôr innen akvakultur, for å predikere effekter på tarmhelse og sykdomsresistens hos fisk, og for å identifisere bioaktive ingredienser som kan ha negative eller positive effekter for dyret. Ved bruk av disse in vitro smittemodellene som kartleggingsverktøy og for å studere isolerte celle- og vevs-funksjoner, kan dessuten antall levende fisk som må ofres reduseres. Arbeidet vil dermed bidra til å sikre optimal tarmhelse hos laksefisk og optimal bruk av bærekraftige fôringredienser, samt bidra til reduksjon av levende fisk som benyttes i forskning.

Present knowledge basis for understanding relationships between nutrition, immune response and production diseases in aquaculture is very limited, not at least due to lack of targeted research tools. The goal of this post-doctoral research fellowship is to employ two established in vitro salmonid intestinal barrier models (the RTgutGC cell line and Ussing chamber technology) as screening systems for predicting effects of novel fish feed ingredients on fish pathogen infection, antigen translocation across the intestine and gut health. Impact on the epithelial barrier function and cell responses will particulary be studied. The proposed work will be closely linked to several currently running research projects (Foods of Norway (RCN), PROMAC (RCN), ArticFunc (RCN/RFFNORD) and GutMatters (FHF)), all with a focus on novel feed ingredients to salmon, functional feed additives and gut health. Scientific achievements from the work will simplify the future screening of increasingly more complex aquafeeds, in order to predict effects on fish gut health and disease resistance, and to identify bioactive compounds having negative or positive effects on the animal. The work will aid in securing optimal fish gut function and healthy fish tolerant to changes in production conditions, and optimal use of feed ingredients from sustainable resources. Thus, the present work will generate knowledge vital for achieving economical and sustainable growth in Norwegian aquaculture. The applicate project meets the call for tools that will contribute to replacement and reduction of live animals in fish research. The project will provide recruitment of a young academic working in an internationally well recognized research group.