Tilbake til søkeresultatene

FRIMEDBIO-Fri prosj.st. med.,helse,biol

Opening future biotechnological possibilities by revealing the acclimation and biogenesis of the photosynthetic apparatus in marine algae

Alternativ tittel: Muliggjøring av fremtidig bioteknologisk bruk av marine alger ved å finne ut hvordan det fotosyntetiske apparatet bygges opp og reguleres

Tildelt: kr 7,6 mill.

Kiselalger er den økologisk viktigste gruppen av mikroalger (planteplankton) og står for 20-25% av den globale primærproduksjonen. Disse algene har også et stort kommersielt potensial og kan brukes til f.eks. biodrivstoff, fôr til akvakulturindustrien, som en kilde til nanomateriale og i bioremediering. Selv om kiselalger er både svært økologisk viktig og har et stort kommersielt potensial, så vet man lite om disse organismene på molekylært nivå. I DiaPhotosynth prosjektet så har vi fokusert på å forstå de molekylære mekanismene som kontrollerer hvordan det fotosyntetiske apparatet bygges opp og reguleres. I Del 1 av prosjektet så undersøkte vi funksjonen til en kloroplastlokalisert kinase som vi mente kunne fungerer som et viktig sensor- og signalleringsmolekyl for å fornemme den fotosyntetiske tilstanden i kloroplasten og for å videreformidle denne informasjonen til cellekjernen. Ved å bruke genediteringsteknikken CRISPR/Cas9 så slo vi ut/laget «knock outs» av genet som koder for proteinet vi ønsket å finne funksjonen til. Vi utsatte mutantene for forskjellige lysbehandlinger for å sjekke om proteinet har en viktig rolle i lysakklimatisering. Resultatene viste at mutantene oppførte seg som villtypeceller under nesten alle lysforhold. Vi observerte kun svært små forskjeller i vekst, fotosyntetisk produktivitet og innhold av fotobeskyttende pigmenter i celler utsatt for høyintensitetslys. Genekspresjonsanalyser av hele genomet til mutantene sammenlignet med villtype detekterte kun et lite antall regulerte gener, og de svært få genene som var forskjellig regulert hadde ukjent funksjon og gav ingen hint om hva funksjonen til kinasen kunne være. Dette tyder på at andre kloroplastlokaliserte kinaser kan kompensere for tap av den som hadde blitt studert så langt i prosjektet. «Gene mining» av genomet til kiselalgen gjorde at vi oppdaget en annen familie med kloroplastkinaser som også har potensial til å være viktig for fotoakklimatisering. På grunn av den svake fenotypen til mutanten vi først valgte å undersøke, så brukte vi resten av prosjektperioden til å fokusere på andre kloroplastlokaliserte kinaser som kunne ha viktige roller i akklimatisering til nye lysforhold. Denne fremgangsmåten var en suksess, og vi lyktes i å identifisere en kloroplastkinase som er essensiell for at algen skal tåle å bli utsatt for lys av høy intensitet over flere dager. Fravær av denne kinasen fører til store endringer i strukturen til de fotosyntetiske membranene (thylakoidene), sakte vekst, redusert nivå av karotenoider (lyshøstingspigmenter) og en redusert evne til å utføre fotosyntese. For å forsøke å identifisere den spesifikke funksjonen til kinasen og årsaken til de observerte effektene når kinasen ikke er til stede i algen, så har vi også sett på endringer i gen- og proteinekspresjon, endringer i proteinfosforylering og effekter på lipidsammensetning i thylakoidemembranene. Disse resultatene blir nå analysert og klargjort for publisering. I Del 2 av prosjektet så var målet å bestemme hvilke proteinkomplekser som er involvert i transport av pigmentbindende proteiner fra kloroplastmembranen til thylakoidene hvor de fotosyntetiske lysreaksjonene skjer. Vi har tidligere karakterisert en ALB3b insertase involvert i å sette pigmentbindende proteiner inn i thylakoidene. Vi uttrykte og renset opp proteininteraksjonsdomenet fra ALB3b i Escherichia coli for å bruke dette som «bait» for å fange opp interaksjonspartnerne fra proteinekstrakt fra kiselalgen. Dessverre så kunne ingen kandidatproteiner identifiseres ved hjelp av denne metoden. Siden proteininteraksjonene er midlertidige og ikke veldig sterke, så er det mest sannsynlig nødvendig å stabilisere dem for å kunne identifisere interaksjonspartnerne. Vi brukte derfor en ny metode hvor interaksjonene kan fikseres ved å tilsette et induserende molekyl. Man kan da utsette prøvene for tøffere behandling under opprensingstrinnene uten å risikere å vaske bort proteinet av interesse og samtidig holde bakgrunnsstøyen på et lavt nivå. I tillegg så kan man identifisere interaksjonene under naturlige forhold i den levende organismen i stedet for å være avhengig av proteinekstrakt generert ved å lysere cellene, noe som potensielt kan føre til feil. Ved å bruke denne metoden, så identifiserte vi ca. 50 proteiner som befant seg nært ALB3b i cellene. Ved hjelp av litteratursøk, publiserte proteomikk dataset og fylogenetiske analyser, så valgte vi ut de proteinene som vi antok hadde størst sannsynlighet for å være ALB3b interaksjonspartnere. Ved hjelp av CRISPR/Cas9-teknikken, så slo vi ut genene som kodet for de utvalgte proteinene, men fenotypisk karakterisering av disse mutantene gav ikke resultatet vi håpet på. Vi konkluderte med at ingen av de utvalgte proteinene er ALB3b interaksjonspartnere.

Project outcomes and impacts in addition to the research results produced during the project period include 1) learning of new skills and methods that will important for future research projects, 2) securing of a permanent position for the project leader as a senior researcher at SINTEF Ocean as a microalgae expert, 3) expansion of the general knowledge base of marine algae that is currently lagging far behind that of terrestrial plants, 4) proof of differences in the biogenesis of the photosynthetic apparatus between plants and diatoms that can be used to argue that more basic research should be performed in this group of organisms. A greater knowledge of diatom biology is important to develop microalgae strains suitable for industrial cultivation increasing the chances of products and biomass from diatoms to contribute to the world's energy, food, and material needs, 5) discovery of the importance of chloroplast kinases in photoacclimation that can form the basis for future research and research applications in the field.

Diatoms are the ecologically most significant group of microalgae contributing 20-25% of the global primary productivity. These organisms also promise a multitude of potential biotechnological applications. Despite the importance of diatoms in nature and biotechnology, functional studies of diatom biology are scarce. In the proposed project we aim to determine the molecular mechanisms that facilitate regulation and biogenesis of the photosynthetic apparatus of diatoms using the model species P. tricornutum. Such information will be valuable for understanding the evolutionary success of diatoms, and also for performing future strain optimization aiming to create an algae strain more suitable for growth in photobioreactors. In Part I of the project we aim to identify the role of reversible phosphorylation of chloroplast proteins in short- and long-term responses to changes in light intensity. We have identified a single copy gene encoding a chloroplast protein containing both a kinase and a phosphatase domain, that we believe can act as a key sensor and signaling molecule of the photosynthetic status of the cell. The kinase domain show homology to STN7 and STN8 that are important for light acclimation in plants/green algae. In Part II we will investigate how diatom pigment-binding proteins (FCPs) are guided to thylakoid membranes. In green algae and higher plants, the molecular players behind this process are known and function in the chloroplast signal recognition particle (CpSRP) pathway. Preliminary analysis of diatom homologs of the CpSRP pathway strongly indicate that transport of FCPs to thylakoid membranes are independent of this pathway. We have previously identified an insertase necessary for efficient insertion of FCP proteins in thylakoid membranes. By determining the interaction partners of this insertase we will identify novel players guiding FCP proteins to thylakoid membranes. Such proteins might be future targets for strain optimization of diatoms.

Publikasjoner hentet fra Cristin

Ingen publikasjoner funnet

Budsjettformål:

FRIMEDBIO-Fri prosj.st. med.,helse,biol

Finansieringskilder