Tilbake til søkeresultatene

FRIMEDBIO-Fri prosj.st. med.,helse,biol

Opening future biotechnological possibilities by revealing the acclimation and biogenesis of the photosynthetic apparatus in marine algae

Alternativ tittel: Muliggjøring av fremtidig bioteknologisk bruk av marine alger ved å finne ut hvordan det fotosyntetiske apparatet bygges opp og reguleres

Tildelt: kr 7,6 mill.

Kiselalger er den økologisk viktigste gruppen av mikroalger (planteplankton) og står for 20-25% av den globale primærproduksjonen. Disse algene har også et stort kommersielt potensial og kan brukes til f.eks biodrivstoff, fôr til akvakulturindustrien, som en kilde til nanomateriale og i bioremediering. Selv om kiselalger er både svært økologisk viktig og har et stort kommersielt potensial, så vet man lite om disse organismene på molekylært nivå. I DiaPhotosynth prosjektet så fokuserer vi på å forstå de molekylære mekanismene som kontrollerer hvordan det fotosyntetiske apparatet bygges opp og reguleres. I Del I av prosjektet så har vi undersøkt funksjonen av en kloroplastlokalisert kinase som vi hadde predikert kunne fungerer som et viktig sensor- og signalleringsmolekyl for å fornemme den fotosyntetiske tilstanden i kloroplasten og for å videreformidle denne informasjonen til cellekjernen. Ved å bruke genediteringsteknikken CRISPR/Cas9 så slo vi ut/laget «knock outs» av genet som koder for proteinet vi ønsket å finne funksjonen til. Vi utsatte så disse mutantene for en rekke forskjellige lysbehandlinger (overføring fra lav til høyintensitetslys, overføring fra mørke til lys, fluktuerende lys, dag/natt sykluser og lys av forskjellige farger) for å sjekke om proteinet har en viktig rolle i fotoakklimatisering. Resultatene viste at mutantene oppførte seg som villtypeceller under nesten alle lysforhold. Vi observerte kun svært små forskjeller i vekst, fotosyntetisk produktivitet og innhold av fotobeskyttende pigmenter i celler utsatt for høyintensitetslys. Genekspresjonsanalyser (RNA seq) av hele genomet til mutantene sammenlignet med villtype kort tid etter et skifte fra lavlys til høylys detekterte kun et svært lite antall regulerte gener, og de få genene som var forskjellig regulert i mutantene sammenlignet med villtypecellene hadde stort sett ukjent funksjon og gav ingen hint om hva funksjonen til kloroplastkinasen kan være. Vi tolker disse dataene som at andre kloroplastlokaliserte kinaser kan kompensere for tap av den som har blitt studert så langt i dette prosjektet. «Gene mining» av genomet til kiselalgen vi jobber med gjorde at vi oppdaget en annen familie med kloroplastkinaser som også har potensial til å være viktig for fotoakklimatisering. På grunn av den veldig beskjedne fenotypen til mutanten vi først valgte å undersøke, så vil vi i den neste prosjektperioden fokusere mer på andre kloroplastlokaliserte kinaser som kan ha viktige roller i akklimatisering til nye lysforhold. I Del II av prosjektet så har vi forsøkt å bestemme hvilke proteinkomplekser som er involvert i transport av pigmentbindende proteiner fra kloroplastmembranen til de indre membranstrukturene, thylakoidmembranene, som er der hvor de fotosyntetiske lysreaksjonene skjer. Vi har tidligere karakterisert en insertase involvert i å sette disse pigmentbindende proteinene inn i thylakoidmembranen. Vi fikk til å uttrykke og rense opp proteininteraksjonsdomenet fra denne insertasen i Escherichia coli for å bruke dette som «bait» for å fange opp interaksjonspartnerne fra proteinekstrakt fra kiselalgen. Dessverre så kunne ingen kandidatproteiner identifiseres ved hjelp av denne metoden. Siden proteininteraksjonene er midlertidige og ikke veldig sterke, så er det mest sannsynlig nødvendig å stabilisere dem for å kunne identifisere interaksjonspartnerne. Vi har derfor tatt i bruk en ny metode som nettopp har blitt etablert i kiselalgen vi jobber med. Ved bruk av denne nye metoden, så kan interaksjonene fikseres ved å tilsette et induserende molekyl. Man kan derfor utsette prøvene for tøffere behandling under opprensingstrinnene uten å risikere å vaske bort proteinet av interesse og samtidig holde bakgrunnsstøyen på et lavt nivå. I tillegg så kan man identifisere interaksjonene under naturlige forhold i den levende organismen i stedet for å være avhengig av proteinekstrakt generert ved å lysere cellene, noe som potensielt kan føre til feil. Alle nødvendige algestammer for å benytte denne metoden har nå blitt laget og vi undersøker nå under hvilke forhold det vil være best å utføre eksperimentet. Potensielle interaksjonspartnere som identifiseres ved hjelp av denne metoden vil i den neste prosjektperioden bli «knocket» ut for å bekrefte at dette er en sann interaksjonspartner og for å karakterisere funksjonen til disse proteinene. Vi håper at vi på denne måten vil være i stand til å identifisere nye algemutanter som potensielt kan være bedre egnet enn villtypealger for vekst i fotobioreaktorer.

Diatoms are the ecologically most significant group of microalgae contributing 20-25% of the global primary productivity. These organisms also promise a multitude of potential biotechnological applications. Despite the importance of diatoms in nature and biotechnology, functional studies of diatom biology are scarce. In the proposed project we aim to determine the molecular mechanisms that facilitate regulation and biogenesis of the photosynthetic apparatus of diatoms using the model species P. tricornutum. Such information will be valuable for understanding the evolutionary success of diatoms, and also for performing future strain optimization aiming to create an algae strain more suitable for growth in photobioreactors. In Part I of the project we aim to identify the role of reversible phosphorylation of chloroplast proteins in short- and long-term responses to changes in light intensity. We have identified a single copy gene encoding a chloroplast protein containing both a kinase and a phosphatase domain, that we believe can act as a key sensor and signaling molecule of the photosynthetic status of the cell. The kinase domain show homology to STN7 and STN8 that are important for light acclimation in plants/green algae. In Part II we will investigate how diatom pigment-binding proteins (FCPs) are guided to thylakoid membranes. In green algae and higher plants, the molecular players behind this process are known and function in the chloroplast signal recognition particle (CpSRP) pathway. Preliminary analysis of diatom homologs of the CpSRP pathway strongly indicate that transport of FCPs to thylakoid membranes are independent of this pathway. We have previously identified an insertase necessary for efficient insertion of FCP proteins in thylakoid membranes. By determining the interaction partners of this insertase we will identify novel players guiding FCP proteins to thylakoid membranes. Such proteins might be future targets for strain optimization of diatoms.

Budsjettformål:

FRIMEDBIO-Fri prosj.st. med.,helse,biol