Exploring the intersection between opto- and epigenetic networks in the parasitic vine Cuscuta

Planter integrerer eksterne signaler i sine interne regulatoriske nettverk og styrer dermed deres reaksjoner på forskjellige miljøforhold. Et av disse signalene er lys, som består av et spektrum av bølgelengder som planter kan skille mellom og reagere på forskjellig. Intensiteten av rødt lys og mørkerødt lys viser plantene om de er i direkte sollys eller i skyggen av andre planter. Mens de fleste planter prøver å vokse bort fra skyggen og mot lyset, søker den parasittiske snylteplanten Cuscuta heller skyggede forhold som for dem indikerer tilstedeværelsen av vertsplanter de kan infisere. Lyskvaliteten bestemmer om Cuscuta klarer å infisere verten eller ikke. Dette skjer enten gjennom tett vikling etterfulgt av produksjon av infeksjonsorganer i mørk rødt (FR-) lys eller løs eller ingen vikling i rødt (R-lys) som er dermed ikke egnet til å forankre parasitten til verten og initiere en infeksjon av vertsvevet. Disse forskjellige atferdsmønstrene byr på miljøvennlige muligheter for å kontrollere uønsket spredning av parasitter i jordbruksområder. Vårt prosjekt tar sikte på å avklare hvordan lyssignalene påvirker måten den genetiske informasjonen oversettes til de forskjellige reaksjonene (Optogenetikk) og hvordan parasitten har forvandlet den vanlige reaksjonen planter viser til en motsatt oppførsel. Vi ønsket spesielt å undersøke hvordan optogenetisk regulering er knyttet til epigenetisk modulering av genuttrukk. Kromoproteiner har evnen til å absorbere spesifikke lysfarger (eller bølgelengder), som kan endre deres konformasjon, og med det deres egenskaper. Plantekromoproteiner som er ansvarlige for å signalisere den relative mengden av R- eller FR-lys, kalles fytokromer. For å avsløre kinetikken or retningen i bevegelsen av parasitten under forskjellige lysforhold, har vi laget time-lapse videoer ved hjelp av et fjernstyrt standard speilreflekskamera. Informasjonen fra de filmene var nødvendig for planlegging av prøvetaking av vev for de molekylære analysene. Ved å bruke sofistikert LED teknologi, kan de endringer i genuttrykket som følge av et lyssignal analyseres relativt nøyaktig. For å fjerne forstyrrende informasjon som en levende vert sender ut, har vi valgt å erstatte vertsplanten med trepinner i våre lysforsøk for å redusere den biologiske kompleksiteten i våre oppsettet. Våre genuttrykksdata viste tydelig en direkte sammenheng mellom R- eller FR-lysbehandling og den resulterende fenotypiske responsen (vikling eller ikke vikling rundt vertstengel) og uttrykk av visse typer transkripsjonsfaktorer. Noen av disse faktorer har ikke tidligere vist seg implisert i denne prosessen. Et annet overraskende resultat var at Cuscuta ser ut til å utnytte andre medlemmer av fytokrom familien enn ikke-parasittiske planter vanligvis bruker. FR-behandlingen forårsaket også andre endringer i metyleringsprofilen på genomet enn R-behandling, som vi tolker som en bekreftelse at en hittil ukjent epigenetisk kontroll-meknisme er involvert i parasittenes lysrespons. Noen epigenetiske signaturer ble funnet i genene og deres promoter-sekvenser, mens andre er funnet i mobile genetiske elementer i nærheten. Siden DNA-metylering er knyttet til små regulatoriske RNAer, ble deres profil og akkumulering i Cuscutas vev også analysert. Gjennom dette fikk vi bekreftet at små RNA-molekylene som er relatert til noen av de regulerte genene akkumulerte under de respektive lysforholdene. Forskningen på sammenhengen mellom disse molekylene og de enkelte epigenetiske endringene som ble observert pågår fortsatt, bl. a. med et forsøk å utvikle en enkel og rimelig metode for «medium-throughput» metyleringsanalyser av enkelte regioner av høy relevans. Tatt sammen, støtter alle dataene våre ideen at det er en solid forbindelse mellom de regulatoriske nettverkene som er involvert i lysoppfattelse og de epigenetiske endringer i Cuscuta. I studiene våre har vi også følget opp ledetråder at infeksjonsorganet, kjent som «haustorium», er regulert av lyskvaliteten men ikke på den samme måten. I denne sammenhengen har vi analysert genuttrykksmønstre til unge, utviklende og modne haustoriaer etter behandling med R- eller FR-lys. Her viste det seg at det finnes forskjeller i de dominerende transkripsjonsfaktorene og deres målgener, og også i de regulatoriske mikroRNA-ene. I denne sammenheng viste verten seg å ha en modifiserende påvirkning av genuttrykket i parasitten. Dette understreker kompleksiteten til interaksjonssystemet og viser at vår tilnærming å bruke et vertsfritt system for de grunnleggende analysene var begrunnet. Kort sagt, har vi så langt bekreftet at Cuscuta byr på en unik mulighet til å forstå hvordan en forstyrrelse i kognitive funksjoner i planter kan føre til evolusjon av nye livsstil og neofunksjonalisering av molekyler.

The parasitic vine Cuscuta reacts to long wavelength far-red light with a rotating shoot movement, followed by coiling around host stems and rapid host infection while red light triggers only shoot elongation and results in a strongly decreased tendency to attack and infect host plants. The genome of Cuscuta campestris contains the red light receptor phytochrome, but lacks several important interacting transcription factors, suggesting that alternative, or possibly even novel, signal transduction pathways are behind this behavior. The project will study the molecular responses of Cuscuta to far-red and red light conditions in order to understand the mechanisms underlying the (far-)red light control of infection. Following a lead that points to the regulation of a component of the RNA-directed DNA methylation (RdDM) machinery by red or far-red light, mRNA expression profiles, small RNA composition and genome-wide DNA methylation signatures under red- and far-red-light illumination will be studied in Cuscuta shoots. The integration of these datasets with the phenotypic read-out (infection organ production or lack of infection organ) will help to identify novel key players of the infection process. In parallel, we will characterize in more detail the component of the RdDM machinery, IDN2, that showed light-responsive expression in preliminary studies. In situ hybridization will reveal whether the induction or repression of IDN2 gene transcription is cell- or tissue-type specific and limited to infective tissue. With the help of a reverse genetics approach using host-mediated virus-induced gene silencing, the effect of a loss of function of this gene on the virulence of the parasite will be studied.