Salmonid alphavirus - recombination products and its impact on disease development, host response and therapeutic possibilities

Pankreassykdom (PD) forårsaket av salmonid alphavirus (SAV) er et stort problem i norsk oppdrettsindustri. Syk fisk får store skader i bukspyttkjertelen og betennelse i hjertet og skjelettmuskel, noe som fører til redusert fiskevelferd og økte kostnader for industrien som følge av lav vekst og tap som følge av at fisken dør. Sykdomsutbrudd i Norge kan forårsakes av enten SAV3 eller SAV2 genotype av viruset og utbrudd forårsaket av SAV3 er antatt å ha større betydning for fiskehelse/-velferd og på industrien. Genotypene er vanligvis separert geografisk, men kan også finnes i samme fylke i et overlappende område mellom disse regionene. I enkelte tilfeller har man også sett begge virusene samtidig i samme individ og dette har gitt en bekymring for hvorvidt disse virusene kan rekombinere og blande arvestoffet sitt med hverandre og skape en farligere variant av viruset. Vi har tidligere vist at SAV3 kan forandre arvestoffet sitt gjennom rekombinasjon og at dette kan resultere i nye virus varianter eller i defekt arvestoff. I prosjektet vil vi studere hvordan slik rekombinasjon skjer og beskrive både levedyktig og defekt resultat. Vi vil også teste ut sjansene for en rekombinering mellom SAV3 og SAV2 og beskrive et eventuelt resultat. Tilstedeværelsen av defekt arvestoff gjennom et sykdomsforløp og hvordan dette påvirker laksens immunforsvar vil også bli studert for begge genotypene. Samlet sett vil prosjektet levere ny kunnskap om mulig rekombinasjon mellom SAV3 og SAV2 og hvilken betydning dette kan ha for sykdom. Ny basalkunnskap vil også genereres rundt mekanismer for rekombinasjon hos virus og spesielt gi signifikant innsikt i rollen og viktigheten av defekte arvestoff. Dette er et produkt av virusinfeksjonen og påfølgende viruskopiering i cellene som har blitt oversett lenge. Allikevel, nyere forskning peker mot at det kan ha en viktig rolle i et «multi-faktoriellt» virussystem. Prosjektet ledes av Førsteamanuensis Aase B. Mikalsen, NMBU, Oslo. Samarbeidspartner er Dr. Marco Vignuzzi, ASTAR Labs, Singapore. Forsker/PhD Turhan Markussen og Professor Øystein Evensen (NMBU) vil også være involvert. MSc Fabian Kropp er i tillegg relatert på et parallelt tre-årig PhD prosjekt. I prosjektets første år har vi fokusert på grunnleggende studier av SAV2 genotypen gjennom fullgenom-sekvensering og dyrkingsstudier i cellekultur, for å oppnå bedre kunnskap om denne genotypen. Videre har vi etablert optimaliserte verktøy og metoder for påfølgende cellekulturforsøk og eksperimentelle smitteforsøk med både SAV3 og SAV2. Revers genetikk vektor plasmider for produksjon av både SAV3 og SAV2 er nå tilgjengelig i laboratoriet. Den tilgjengelige SAV3 vektoren har blitt brukt til produksjon av et «rent» utgangspunkt av full-lengde genom som utgangspunkt for seriepassering av viruset i cellekultur inkl. mikroskopstudier og studier av forskjeller i viruskonsentrasjon på utvalgte tidspunkt ved NMBU. Virus høstet ved utvalgte tidspunkt har blitt analysert for tilstedeværelse av defekt arvestoff, dvs. SAV3 RNA med delesjoner. Vi har identifisert spesifikke varianter av defekt arvestoff som går igjen over tid og øker i konsentrasjon. Dette indikerer at de kan konkurrere med levedyktig arvestoff, som er interessant og viktig progresjon i prosjektet. DVG kandidater med potensielle inhiberende karakteristikker har blitt valgt ut og testing av deres effekt på virus replikasjon pågår og er under optimalisering. Et in vivo smitteforsøk på laks parr pågår. Dette inkluderer grupper med enten SAV3 eller SAV2 smitte og hjertevevprøver tatt over tid vil bli analysert for tilstedeværelse av defekte virus genomer, karakterisert og resultater sammenlignet med tilsvarende fra in vitro forsøket. DVG tilstedeværelse og karakteristikker vil også bli korrelert med virus nivåer, skader i hjertevev og immunresponser. Analyser av prøver fra uke 0-4 etter smitte har startet. Vi har også i de første årene av prosjektet startet studier av hvordan tilstedeværelse av høye konsentrasjoner av defekt arvestoff kan påvirke utfallet av diagnostikk utført med PCR baserte metoder. Her har forskjellige primersett blitt designet for deteksjon av arvestoff med og uten delesjoner og disse har foreløpig blitt effektivitetstestet på et mindre utvalg SAV3-positive prøver fra cellekulturdyrking og felt.

Pancreas disease (PD) is a major disease in Norwegian salmon farming. It is a notifiable disease and Norwegian Food Safety Authorities have established national regulations in order to limit its spread. Despite so and the use of commercial vaccines, number of reported PD cases remains high. The disease causes substantial economic losses every year and has also a welfare impact on the fish and quality of the final product (flesh quality). SAV3 has recently been shown to occur a co-infection with sub-type 2 in Norway. The focus of this project builds on previous results describing RNA recombination of SAV3 in salmon. Recombination events during infection has raised concern that SAV3 can recombine with SAV2 RNA, when infecting the same individual, the outcome being unpredictable. So we will explore possible recombination events between SAV3 and SAV2 and study and characterise the outcome. We have previously shown that recombination is imprecise, which results in high levels of defective RNA which until recently was regarded as not useful for virus replication. Recent research on mammalian viruses indicates that such defect RNA might be relevant in a multi-component viral system. Through collaboration with Dr. Vignuzzi's group at Pasteur Institute who is in the forefront of this research, we will explore the impact of defective RNA on virus replication, host responses and implications for diagnosis. We will include studies on mechanisms resulting in the deletions, i.e. role of RNA secondary structures. New knowledge will shed light on SAV infection in salmon, provide more details on immunological reactions to the infection, and a particular novel and ambitious aspect is use of defective genomes as a therapeutic approach to cure infection and disease, mechanisms not studied in any target host for any virus previously. This will provide a basis for health control and reduce disease and mortality related to SAV infection and will provide comparative knowledge.