ERA-NET: Recycling crustaceans shell wastes for developing biodegradable wastewater cleaning composites (BIOSHELL)

Denne prosjektets periodiske rapport oppdaterer forskningsresultater levert av NIBIO forskningsgruppe siden 01.12.2022. De tidligere utviklede semi-IPN-hydrogelene har vist store patogener og ARG-fjerningseffekter i avløpsvann (WW). Som en kontinuerlig innsats for utvikling av nye nanomaterialer, ble nye materialer produsert for videre undersøkelse. Disse nye variantene ligner i prinsippet til de tidligere utviklet produktene, slik som å benytte kitosan enten fra kommersiell kilde (CC); avledet fra kommersielt kitin (CCH); eller fremstilt fra rå marine avfall, f.eks. rekeskall (SHC). Imidlertid ble en ny komponent, dvs. PEGDA 700 (en hydrofil biopolymer) tilsatt til de nye hydrogeler. Variantene var i tillegg tatt hensyn av mengdebalansen mellom vinylbenzyltrimetylammoniumklorid (VBTAC) og PEGDA. Avløpsvann prøver etter å ha blitt behandlet med disse nye materialene ble sendt til NIBIO for molekylære undersøkelser. De behandlede avløpsvann sammen med rå/originale avløpsvann ble gjennomgått DNA-ekstraksjon for å skaffe mikrobiell genomisk DNA (gDNA) ved bruk av Qiagen PowerWater-kitet. Etter kvalitetskontroll og konsentrasjonsmåling ble gDNA brukt til qPCR-patogenanalyser ved bruk av utviklede markørgener. Blant alle undersøkte prøvene ble Campylobacter jejuni og Legionella pneumophila ikke påvist. Samlet sett viste alle testede serier svært varierende i patogenfjernings kapasitet, fra 16 % til 90 %, men vist mest effektivitet mot Enterococcus faecalis (Ent) (51-78%), Clostridium perfringens (CP) (33-90%) og Salmonella typhimurium (STM) (23-74%). Blant dem indikerte seriene med høyere PEGDA og mindre VBTAC (V0.5-serien) bedre resultater enn de med lavere PEGDA og høyere VBTAC (IPN-serien). Mer presist, presterte CC-V0.5 best ved fjerning av Ent, CP og STM, mens SHC-0.5 representerte den nest beste. I tilfelle av Shigella spp., viste CC-IPN sammenlignbar aktivitet som V0.5-serien oppnådd 45-50 % reduksjonsrate. For fjerning av Shiga-toksinproduserende E. coli (STEC), klarte alle varianter lignende effekten på 40-50%. I tillegg til patogenundersøkelse ble også antibiotika resistens gener (ARG-er) analysert på det ekstraherte gDNA. I samsvar med tidligere funn ble vanA og mecA ikke påvist i alle testede prøver. I likhet med aktivitetstrenden identifisert for patogenundersøkelse, viste V0.5-serien betydelig høyere ARG-dempende effekter enn IPN-serien, spesielt mot intI1 (55-69%), blaCTXm (56-62%), ermB (57-75%), qrnS (37-78%), sul1(60-68%) og tetO (46-66%). Interessant nok, i tilfeller av multimedikamentresistensgener, som for eksempel, efflux-pumpe gener, presterte IPN-serien klart bedre når det gjaldt å redusere qacE1 (64-100%) og qacA/B (52-100%). Dette er et slags overraskende funn som de underliggende mekanismene krever ytterligere undersøkelser. Oppsummert indikerte den overordnede molekylære vurderingen at de utviklede nye hydrogelene avledet fra marint avfall (SHC-serien) kan utøve sammenlignbar/like god patogen- og ARG-fjerningseffektivitet som CC (kommersiell) og CCH (avledet fra kommersielt kitin), spesielt når de er høyere. mengde PEGDA700 tilsett i formelen. Med tanke på relativt høy pris på VBTAC, er det ganske kostnadseffektivt å bruke mer PEGDA700 i stedet. De nyutviklede nanokomposittene er først og fremst ment for metallretensjon. Det tar store fordeler med overlegen biologisk nedbrytbarhet, biokompatibilitet, hydrofilisitet arvet av PEGDA. De dannede strukturelle hydrogelene i 3D-nettverket kan bidra til adsorpsjon av metallioner og andre stoffer, og dermed lette fjerning av forurensninger fra WW. Ved å kombinere med bioaktivitet bevist VBTAC, basert på vår nylige undersøkelse, kan de nye nanomaterialene også utøve betydelige patogener og ARG retensjon og fjerning. For dette formål viste den nye typen hydrogeler generert fra marint avfall styrket av tilførselen av PEGDA og VBTAC å være effektiv mot patogener og ARG-er i WW, i tillegg til deres utviste metallfjerningseffekter, for eksempel mot Cu, Ni og Cd (undersøkt og analysert av andre prosjektpartnere).

After 3 years collaborative endeavor of all project's partners regardless of COVID impact, BIOSHELL has achieved the major goals as outlined/anticipated in the proposal. The key outcomes are reflected as such: (i) successful development of chitosan extraction from marine wastes derived from fishery and seafood production; (ii) successful generation of novel chitosan-based nanocomposites for pathogen and ARGs removal from wastewater; (iii) Establishment of genetic marker-based molecular diagnostic platform for reliable and rapid assessment of treatment effectiveness. The achieved project results have been effectively and intentionaly disseminated to broad audiences through e.g. open access scientific journals as such: 1. Paruch, L., Paruch, A.M., Neblea, I.E, Iordache, T.-V, Olaru, A.G., Chiriac, A.-L, Sarbu, A. 2023. Effective removal of antibiotic resistance genes from wastewater using marine waste-derived novel nanocomposites, Environmental Technology & Innovation, 32,103320. https://doi.org/10.1016/j.eti.2023.103320. 2. Neblea, I.E., Chiriac, A.-L., Zaharia, A., Sarbu, A., Teodorescu, M., Miron, A., Paruch, L., Paruch, A.M., Olaru, A.G., Iordache, T.-V. 2023. Introducing semi-interpenetrating networks of chitosan and ammonium-quaternary polymers for the effective removal of waterborne pathogens from wastewaters. Polymers, 15(5), 1091. https://doi.org/10.3390/polym15051091 3. Paruch, L., Paruch A.M. 2022. An overview of microbial source tracking using host-specific genetic markers to identify origins of fecal contamination in different water environments. Water, 14(11), 1809. https://doi.org/10.3390/w14111809 4. Paruch, L. 2022. Molecular Diagnostic Tools Applied for Assessing Microbial Water Quality. Int. J. Environ. Res. Public Health,19, 5128. https://doi.org/10.3390/ijerph19095128 5. Paruch L, Paruch A.M. 2022. Molecular Identification of Infectious Enteropathogens in Faeces of Healthy Horses. Microbiol Insights. 15,11786361221089005. http://doi.org/10.1177/11786361221089005 6. 7. Paruch L., Paruch A.M., Iordache T-V, Olaru A.G., Sarbu A. 2021. Mitigating antibiotic resistance genes in wastewater by sequential treatment with novel nanomaterials. Polymers, 13(10), 1593. https://doi.org/10.3390/polym13101593 The obtained data have been also reached out to broader audience through national and international conferences, symposiums as oral presentation and posters (by combining the results from different partners). In terms of IPR protection, several national (in Romania) patents have been filed/in application. Since the projects outcomes are innovative and appealing in technology aspect, the methodology and novel nanoproducts have great potential in post-project period to attract interest for technology upgrading/transfer in industry (e.g. novel nanoproducts fabrication using massive marine wastes) and wastewater treatment sectors (e.g. integrating the developed nanomaterials into the biological purificaiton filter media).

Wastes from agriculture and fishery cause harmful effects on the environment and implicitly on humans. Yet, many of these wastes can be recycled. One of the current global issues refers to minimizing waste production, effective wastewater treatment, biosafe food production, and reducing hazards from the exposure to pathogens. Most of the threatening microorganisms, especially Emerging Pathogens (EPs), derive from wastewater. Moreover, antibiotics residues present in wastewater lead bacterial pathogens to develop Antibiotic Resistance Genes (ARGs). In addition, heavy metals are among the most harmful non-microbial pollutants due to their toxicity to humans. The BIOSHELL project aims at synergistically solving economic, environmental and health problems caused by agricultural and food industry wastes. The project focuses on utilizing the wastes from seafood preparation, such as crustacean carcasses, in the development of innovative and efficient inorganic-organic functionalized hydrogel nanocomposites, suitable to facilitate the sustainable wastewater purification technologies for heavy metals retention, antibiotics elimination, EPs and ARGs removal. Functional biopolymer-based hydrogels starting from valorized crustacean's shell wastes will be developed both for the metal and antibiotics retention in waters as well as for anti-bacterial treatment. These competitive materials will be Ion Imprinted Polymers (IIPs) or Molecularly Imprinted Polymers (MIPs). They will benefit from new synthesis methodologies applied for chelating the chitosan nanocomposites and for the chemical grafting of the bactericidal hybrid surfaces. The development of new approaches for the valorization of crustacean wastes, by the new functionalized bio-hydrogels, will improve water purification and wastewater treatment in general, but particularly for decentralised locations/on-site systems. The regeneration of new bio-based agents shall also be targeted.