Physiology, pharmacology and immunology of ion-channels in Atlantic salmon and the salmon louse, Lepeophtheirus salmonis

Ionekanaler er viktige cellulære mekanismer i alle levende organismer. De regulerer ionestrømmen over cellemembraner i celler som nevroner og muskelceller. Ionekanaler er målprotein for en lang rekke medikamenter. I dette fireårige prosjektet vil de forskjellige ionekanalene som er til stede i både Atlantisk laks og lakselus bli forsøkt identifisert. Genomene fra laks og lakselus er fullt sekvensert, og verktøyene for en grundig, komparativ bioinformatisk analyse i begge artene er nå tilgjengelige. Målet for prosjektet er å identifisere ionekanalene som finnes i laks og lakselus, og å evaluere om noen av disse er mulige mål for kjemisk og/eller immunologisk kontroll. Dette vil bli gjort ved 1) Bioinformatisk identifisering og sammenligning av ionekanaler i laks og lakselus 2) Evaluering av utvalgte ionekanaler som målproteiner for kjemiske midler, basert på toksisitetstester og RNA-interferensstudier, og etter ekspresjon i Xenopus egg og tester med modellsubstanser 3) Evaluering av utvalgte ionekanaler som mulige immunologiske målproteiner, basert på bioinformatisk evaluering av immunologiske egenskaper og immuniseringsforsøk Prosjektet er organisert i fire arbeidspakker. WP 1 - Bioinformatikk I den første perioden er aktuelle bioinformatiske verktøy brukt til søk i laksens og lakselusas genomer og transkriptomer for å identifisere gener som koder for ionekanaler. Flere åpne datakilder er brukt: Salmobase (https://salmobase.org/) og NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/?val=GIYK01) for laks, og Licebase (https://licebase.org/) og NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Lepeophtheirus+salmonis) for lakselus. Gener som koder for spenningsstyrte natriumkanaler er undersøkt spesielt siden de er første fokus i WP 2 og WP 3. WP 2 - Ekspresjon av utvalgte ionekanaler i Xenopus egg Før prosjektet startet var lakselusas nikotinerge acetylcholinreseptorer klonet. Dette er målproteinet for det nylig godkjente lakselusmidlet imidakloprid (Ectosan). I starten av dette prosjektet er gener som koder for den samme reseptoren i laks identifiserte, og cRNA som skal sprøytes inn i Xenopus-eggene er syntetisert. Kloning og testing med en rekke forbindelser blir gjort tidlig i 2022. I tillegg er det jobbet med spenningsstyrte natriumkanaler i lakselus, antatte målproteiner for pyretroider. Det var vanskelig å lage et plasmid som kunne bli oppformert i E. coli med dette genet. I stedet er deler av genet samt resten av plasmidet syntetisert ved hjelp av PCR, og bitene er spleiset sammen. Tilnærmingen ser ut til å fungere. Noen tester i laboratoriet gjenstår før cRNA kan isoleres og injiseres i Xenopus egg i begynnelsen av 2022. WP 3 - Validering av Xenopus-modellen mot in vivo resultater Ekspresjon av gener som koder for ionekanaler i Xenopus egg og testing av disse med elektrofysiologiske teknikker gir verdifull informasjon. Det er imidlertid ikke gitt at de har samme effekt i et helt individ. I WP 3 er det etablert effektive protokoller for å studere effekten av modellsubstanser og legemidler på copepoditter. Grupper med parasitter eksponeres for 2-folds fortynninger av middelet som undersøkes. Tidligere ble hver gruppe eksponert i 1-liters flasker med sjøvann, men vi har vist at dette enkelt kan gjøres i brønner à 350 mikroliter i 96-brønners mikrotiterplater uten at resultatene påvirkes. Hver brønn tilsettes 10 copepoditter. Tester med 15 ulike substanser som antas å virke på spenningsstyrte natriumkanaler er fullført. Resultatene sammenholdes med resultatene fra WP 2. I prosjektet venter vi at det identifiseres ionekanaler der forskjellen er stor mellom kanalene i laks og lakselus. Slike kan være målproteiner for legemidler eller vaksiner. For å teste om de er essensielle for overlevelsen har vi satt opp metoden RNA-interferens. Det første larvestadiet eksponeres for en variant av genet som skal undertrykkes med den nevnte metode. Parasitten mobiliserer en forsvarsmekanisme som kutter det opp i små biter. Samtidig kuttes parasittens egenproduserte mRNA for proteinet opp, og ionekanalen blir ikke produsert. Metoden er etablert i mikrotiterplater. Den fungerer, men det har vært utfordringer med å få larvene til å utvikle seg til copepoditter, også for kontrollene. Noe metodeutvikling gjenstår. WP 4 - Immunologisk potensial Denne arbeidspakken er ikke planlagt startet før mot slutten av 2022.

Ion-channels are ancient cellular mechanisms present in all living organisms. A major function is regulation of ion flow across cell membranes in excitable cells like neurons and muscle cells. Ion-channels are targets for numerous drugs used against a wide variety of conditions such as elevated blood pressure, anxiety and parasites. The anti-sealice agents azamethiphos, deltamethrin and emamectin benzoate all act – by different mechanisms - on ion-channels. In this four-year project, the various ion-channels present in both Atlantic salmon and the salmon louse will be sought identified. The physiological function for the most relevant will be described using molecular, toxicological, electrophysiological and bioinformatics tools. Ion-channels in salmon lice that either are not present in the salmon, or show large differences between the species, can be potential targets for chemical or immunological control. The project has four interacting work packages. In WP 1, the salmon and salmon louse genomes will be screened for genes coding for various ion-channels using bioinformatic tools. These will be compared to elucidate significant differences between the host (salmon) and the parasite (salmon louse). In WP 2, a selection of identified ion-channels from the host and the parasite will be attempted cloned into Xenopus laevis oocytes and tested with two-electrode voltage clamp electrophysiological techniques. The influence of model substances on the gating properties will be tested. WP 3 will be a validation of ex vivo results from WP 2 against in vivo toxic effects on different developmental stages of the parasite using model substances or RNAi. In WP 4, selected recombinant proteins will be tested as vaccine antigens in small-scale proof-of-concept challenge trials.