Målet for prosjektet har vært å identifisere ionekanalene som finnes i laks og lakselus, og å evaluere om noen av disse er mulige mål for kjemisk og/eller immunologisk kontroll.
WP 1 - Bioinformatikk
Bioinformatiske verktøy er brukt til søk i laksens og lakselusas genomer og transkriptomer for å identifisere gener som koder for ionekanaler. Datakilder: Salmobase (https://salmobase.org/) og et nytt transkriptom fra samarbeidende forskere (Ramberg et al. 2021, https://doi.org/10.3389/fgene.2021.656334) for laks, samt Licebase (https://licebase.org/) og vårt eget transkriptom for kopepoditter og adulte hunner i lakselus (Hansen et al. 2023, https://doi.org/10.3389/fmars.2023.1167402).
WP 2 - Ekspresjon av utvalgte ionekanaler i Xenopus egg
En aktuell ionekanal-gruppe er nikotinerge acetylcholin-reseptorer (nAChR) (Rufener et al. 2020, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008715). Dette er målproteinet for lakselusmidlet imidakloprid (Ectosan) som fikk norsk godkjenning i 2021. Tre varianter av laksens nAChR er klonet samt tre nAChR-kanaler fra lakselus. Sammenliknende undersøkelser av hvordan identifiserte nAChR påvirkes av aktiverende og inaktiverende forbindelser pågår.
Det er også jobbet med tre andre ionekanal-par fra laks og lakselus:
1) Glycin-reseptorer fra laks og glutamat-reseptorer fra lakselus. Dette er beslektede ionekanaler som har samme funksjon, men med betydelige ulikheter i oppbygging. De gir økt innstrømming av negativt ladede kloridioner i cellene når de aktiveres. Glutamatreseptorer i lakselus er målproteinet for emamektinbenzoat (Slice). Det ble vist at laksens glycinreseptor også ble aktivert av denne forbindelsen, samt to andre midler i samme gruppe, men ved høyere konsentrasjoner. Det var ingen kryssrespons mellom de naturlige transmitterne.
2) GABA-reseptorer fra laks og lakselus. Dette er også ionekanaler som gir økt innstrømming av negativt ladede kloridioner. Kanaler fra både laks og lakselus er klonet inn i Xenopus-egg. Dette er ionekanalene som en relativt ny gruppe ektoparasittmidler, isoxazoliner, virker på. Disse er ikke i bruk mot lakselus. Sammenliknende undersøkelser pågår.
3) Spenningsstyre natriumkanaler. Dette er ionekanaler i nerve- og muskelceller som sørger for at det elektriske signalet beveger seg langs cellen. Når de inaktiveres stopper signalet opp. Dette er målproteinet for lakselusmidlet deltametrin (AlphaMax). En av natriumkanalene fra laks er klonet inn i Xenopus-modellen og fungerer. Det har vist seg svært vanskelig å klone tilsvarende ionekanaler fra lakselus. Forsøk pågår fortsatt.
WP 3 - Validering av Xenopus-modellen mot in vivo resultater
I WP 3 er det etablert effektive bioassay-protokoller for å studere effekten av modellsubstanser og legemidler på levende kopepoditter. Grupper med parasitter eksponeres for 2-folds fortynninger av middelet som undersøkes. Dette kan enkelt gjøres i brønner à 350 mikroliter i 96-brønners mikrotiterplater uten at resultatene påvirkes. Hver brønn tilsettes 10 kopepoditter. Tester med substanser som antas å virke på ionekanalene vi undersøker er i stor grad fullført. Resultatene sammenholdes med resultatene fra WP 2.
Ionekanaler der forskjellen i sensitivitet er stor mellom laks og lakselus kan være målproteiner for legemidler eller vaksiner. Vi har satt opp metoden RNA-interferens (RNAi) for å teste dette. Det første larvestadiet av lakselus eksponeres for en variant av genet som skal undertrykkes, for deretter å teste overlevelse og genuttrykk. RNAi-eksperimenter er gjennomført med tre spenningsstyrte natriumkanaler og to nAChR-kanaler fra lakselus. Vi klarte ikke å påvise vesentlige effekter på utviklingen fra det første larvestadiet (nauplius I) til det infektive stadiet (kopepoditt) for noen av disse. Imidlertid kunne en signifikant hemming av genuttrykkene påvises.
WP 4 - Immunologisk potensial
Her er det undersøkt om DNA-vaksiner fremstilt mot deler av aktuelle ionekanaler kan gi beskyttelse mot lakselus hos laksen. Resultater fra WP 1 samt andre eksterne kilder er brukt for å velge ut gener. Aktuelle ionekanaler er først modellert i 3D ved hjelp av programmet AlphaFold 2. Deretter er fragmenter av genet, kodende for deler av proteinet som er vitalt for funksjon av kanalen samtidig som de er tilgjengelig for antistoffer, identifisert. Aktuelle DNA-vaksinekandidater er fremstilt. I alt er 15 vaksinekandidater mot ionekanaler i nervesystemet, 6 mot ionekanaler i andre vev og 9 mot ionekanaler assosiert med sensoriske funksjoner framstilt. Av disse er 20 testet i smitteforsøk med lakselus. Et nytt forsøk med de resterende gjøres i november/desember 2024.
Plasma fra 10 fisk immunisert med hver vaksinekandidat vil bli testet for potensiell letal effekt på lakseluskopepoditter i bioassayforsøk i november 2024. For ionekanaler som vi har Xenopus-modeller for vil plasma også bli testet for direkte effekt på ionekanalen. Dette er planlagt våren 2025.
Ett arbeid er publisert og fire er under utarbeidelse.
Ion-channels are ancient cellular mechanisms present in all living organisms. A major function is regulation of ion flow across cell membranes in excitable cells like neurons and muscle cells. Ion-channels are targets for numerous drugs used against a wide variety of conditions such as elevated blood pressure, anxiety and parasites. The anti-sealice agents azamethiphos, deltamethrin and emamectin benzoate all act – by different mechanisms - on ion-channels. In this four-year project, the various ion-channels present in both Atlantic salmon and the salmon louse will be sought identified. The physiological function for the most relevant will be described using molecular, toxicological, electrophysiological and bioinformatics tools. Ion-channels in salmon lice that either are not present in the salmon, or show large differences between the species, can be potential targets for chemical or immunological control.
The project has four interacting work packages. In WP 1, the salmon and salmon louse genomes will be screened for genes coding for various ion-channels using bioinformatic tools. These will be compared to elucidate significant differences between the host (salmon) and the parasite (salmon louse). In WP 2, a selection of identified ion-channels from the host and the parasite will be attempted cloned into Xenopus laevis oocytes and tested with two-electrode voltage clamp electrophysiological techniques. The influence of model substances on the gating properties will be tested. WP 3 will be a validation of ex vivo results from WP 2 against in vivo toxic effects on different developmental stages of the parasite using model substances or RNAi. In WP 4, selected recombinant proteins will be tested as vaccine antigens in small-scale proof-of-concept challenge trials.