MoleculAr harvesTing with electroporation, microfluidics and nanoparticles for dIagnoSticS and thErapy of heterogeneous solid tumours

En stor utfordring innen kreftbehandling er at kreftsvulster ofte består av områder med svært ulike egenskaper. De ulike områdene reagerer ulikt på samme behandling. Diagnose og valg av behandlingsregime er ofte basert på resultater fra biopsiprøver - små vevsprøver som tas fra kreftsvulsten. Hvis en kreftsvulst har områder med egenskaper som er veldig forskjellige fra vevsprøvene som er grunnlaget for diagnosen, er det stor sannsynlighet for at den valgte behandlingen ikke tilintetgjør hele kreftsvulsten. Prosjektet MATISSE har som mål å kombinere flere elementer innen nanoteknologi for a lage et nytt diagnostisk verktøy som analyserer flere områder fra samme kreftsvulst, og dermed gir bedre grunnlag for å velge riktig behandlingsregime og tilintetgjøre hele kreftsvulsten. Dette vil gjøres ved å utvikle en nål som kan settes inn i vevet og ekstrahere molekylært innhold fra kreftcellene. En slik tilnærming vil potensielt eliminere behovet for komplekse prosedyrer for uttak av vevsprøver og tillate analyse av mange områder fra samme kreftsvulst. Inne i nålen vil molekylært innhold fra kreftcellene ekstraheres ved en metode som kalles elektroporering. Under elektroporering dannes det porer i cellemembranene ved at man setter på et elektrisk felt, noe som gjør at molekyler fra cellenes innside slipper ut. Dette innholdet trekkes så ut av vevet gjennom nålen og overføres til en sentrifugal mikrofluidikk-skive som separerer ut de relevante biomolekylene, kalt proteiner og RNA, fra resten av prøven. Den sentrifugale mikrofluidikk-skiva kan analysere flere prøver samtidig og gjør dermed diagnoseprosessen raskere. Basert på diagnosen som settes vil overflaten til såkalte terapeutiske nanopartikler bli modifisert slik at de binder spesifikt til biomolekylene som ble identifisert i analysen. Dermed vil forhåpentligvis legemidlene som nanopartiklene bærer spres rundt til hele kreftsvulsten og øke sannsynligheten for vellykket kreftbehandling betraktelig. Status: I begynnelsen av prosjektet arbeidet vi med å undersøke hvilke prosedyrer for isolasjon av protein og RNA fra den elektroporerte prøven som vi skal implementere på mikrofluidikk-enheten. Vi konkluderte med å fokusere på væske-væske ekstraksjonsmetoder for protein i første omgang. Vi snevret det ned til to mulige prosedyrer. Den ene er en kommersiell proteinekstraksjonsmetode fra Biological Industries. Den andre er en "grønn kjemi" prosedyre for proteinekstraksjon publisert i 2015: Xu K, Wang Y, Huang Y, Li N, Wen Q. A green deep eutectic solvent-based aqueous two-phase system for protein extracting. Anal Chim Acta. 2015 Mar 15;864:9-20. doi: 10.1016/j.aca.2015.01.026. Epub 2015 Jan 23. PMID: 25732422. Prosedyren fra Biological Industries benytter helsefarlige kjemikalier, noe som kompliserer den eksperimentelle testingen på sentrifugaloppsettet og er lite praktisk for klinisk anvendelse. Den grønne prosedyren benytter ikke-helsefarlige ("grønne") kjemikalier og er med det bedre egnet for anvendelsen, men denne er ikke velkjent for konsortiet. Det viste seg imidlertid at denne er vanskelig å reprodusere og oppnå pålitelige resultater. Grunnet usikkerheten i hvilken proteinisolasjonsprosedyre vi kommer til å benytte til slutt har vi valgt å fokusere utviklingen av design for mikrofluidikk-enheten på enhetsoperasjoner som er felles for alle væske-væske ekstraksjonsmetoder og der vi ser størst potensial for forbedring og innovasjon, nemlig på blanding og deretter separasjon av de to ikke-blandbare væskene for å oppnå effektiv overføring av målmolekylene fra den ene til den andre fasen. En detaljert litteraturstudie er utført for å identifisere relevante løsninger, og allerede eksisterende løsninger har blitt vurdert og brukt som grunnlag for å utvikle nye, innovative løsninger på problemstillingen. Vi har valgt å fokusere på bruk av små gassbobler som beveger seg gjennom væskefasene i mikrofluidikksystemet pga. tetthetsforskjeller. Boblene forårsaker kaotisk blanding av de to ikke-blandbare væskefasene, noe som sikrer god massetransport mellom fasene, etterfulgt av væskefaseseparasjon under videre sentrifugering. Vi har gjennomført en rekke teoretiske beregninger og etablert numeriske modeller for å simulere og evaluere ulike designvarianter og parameterkombinasjoner for væskevolum, sentrifugehastighet, utforming av mikrokanaler og -kammere, etc. I parallell har vi videreutviklet vårt eksperimentelle oppsett slik at det nå tillater å pumpe inn gassbobler i mikrofluidikkbrikken mens den roterer, samt utviklet flere brikkedesign for videre forsøk. Et grønt modellsystem for væske – væske ekstraksjon har blitt etablert og verifisert i innledende eksperimenter. Prosjektet er nå klart til å gå inn i sin siste fase der det vil gjennomføres en rekke forsøk for å studere og optimalisere den nyetablerte væske-væske ekstraksjonsmetoden, med høyt potensiale for vitenskapelig publisering.

Intratumor heterogeneity is a major challenge preventing the wide-spread adaptation of a personalized medicine. The objective of this proposal is to develop a complementary set of beyond state-of-the-art, nanotechnology-driven tools for effective diagnostics of intratumor heterogeneity and subsequent therapy with tailored nanoparticles. The methods include (i) collection of molecular biopsies at improved spatial resolution (~100 µm) by tissue permeabilisation with electroporation, (ii) automation of sample preparation on electroporated extracts (RNA and proteins extraction) using centrifugal microfluidics and (iii) application of therapeutic gold and silica nanoparticles addressing the tumor subclonality. The hypothesis behind the MATISSE project is that the combination of the proposed technologies will for the first time enable dissecting molecular cartography and heterogeneity of solid tumours addressable by nanoparticle drugs. To test the hypothesis, international consortium of experts in engineering, nanotechnology, medicine, biochemistry, and machine learning will jointly tackle the following specific challenges: 1) development of a novel e-biopsy device for molecular harvesting in vivo; 2) determination of the electric pulse parameters for RNA and protein extraction from tumour model in mice and excised human skin and internal tumours; 3) development of a microfluidic technology for interfacing e-biopsy devices and laboratory instrumentation that ensures integrity of data collection during biopsies analysis; 4) development of nanoparticles combinations to address the heterogeneity of the 4T1 model tested in vivo. The project involves partners from 4 countries (Project leader: Tel Aviv University). SINTEF will focus on the development of a centrifugal microfluidic device for automation of sample preparation (RNA and protein extraction), interfacing of e-biopsy devices with other instrumentation to ensure integrity of data collection during biopsies analysis.