Development of fully functional, species-specific nicotinic acetylcholine receptor models from arthropods

Elektriske signaler overføres fra en celle til en annen celle ved hjelp av signalstoffer som frisettes fra den ene cellen og aktiverer spesielle reseptorer i den neste cellen. Et svært viktig signalstoff i de fleste dyrearter er acetylcholin og reseptorene som aktiveres kalles acetylcholinreseptorer. I en organisme finnes det flere varianter av disse reseptorene, blant annet noen som aktiveres av nikotin, og dermed har fått navnet nikotinerge acetylcholinreseptorer (nAChR). Denne gruppen av reseptorer er satt sammen av fem proteiner, og forskjellige kombinasjoner av like eller ulike proteiner kan gi opphav til reseptorer med litt ulike egenskaper. En av de mest brukte gruppene insektmidler i verden er neonikotinoidene. Disse aktiverer nAChR på samme måte som nikotin og aceylcholin, men med lengre virkningstid. Denne gruppen insektmidler er kommet i et sterkt, negativt søkelys fordi de kan ha uønskede effekter på nyttige insekter, f.eks. bier. Neonikotinoidene er både direkte giftige, og de kan i lavere doser ha uønskede effekter, som at biene mister orienteringsevnen. Ett av neonikotinoidene ble nylig markedsført mot lakselus, som er et lite krepsdyr og en parasitt på laksefisk. Det har lenge vært ønskelig, men vanskelig, å studere effektene av neonikotinoider på reseptornivå hos insekter og andre leddyr, fordi ingen tidligere har klart å uttrykke en komplett reseptor fra denne dyregruppen i et eksperimentelt modellsystem. Vår gruppe klarte imidlertid dette, ved å klone de nødvendige genene fra lakselus inn i umodne froskeegg (oocytter) og deretter nøyaktig måle reseptorenes egenskaper. Det ble vist at det finnes ulike kombinasjoner av proteiner som danner acetylcholin-følsomme reseptorer og at effekten av neonikotinoider på disse reseptorene fra lakselus er litt forskjellig. I dette prosjektet bygges det videre på disse resultatene. For selv om denne reseptorgruppen har betydelige likhetstrekk mellom ulike leddyr, er de ikke identiske. Derfor må reseptoren uttrykkes basert på gener for hver art man vil studere. Målsettingen er å sette sammen funksjonelle reseptorer fra to insektarter (bier og stikkmygg), samt edderkoppdyrene spinnmidd og skogflått, og teste deres egenskaper etter aktivering med acetylcholin, nikotin og neonikotinoider. Så langt er det identifisert mer enn 50 gener som koder for nAChR-proteiner fra de ulike artene. For å finne nøyaktige koder for proteinene, trengs detaljert kjennskap til gen-sekvensene. Det har derfor vært nødvendig å undersøke disse mer spesifikt i lakselus og flått. Som resultat har vi iblant annet dentifisert en ny reseptor fra lakslus, og det kartlegges nå om den responderer på acetylcholin og neonikotinoider. Optimalisering av protokoller for å få frem riktige gensekvenser har også vært essensielt for noen av sekvensene. Forskjellige protein-kombinasjoner er under testing i det eksperimentelle modellsystemet for å identifisere det som gir respons etter aktivering med acetylcholin, og nye kombinasjoner har allerede vist aktivitet. Siden vi har kommet litt lenger med to reseptorer fra lakselus, er det en målsetning å bestemme den nøyaktige romlige plassering av proteinene som lakselus-reseptorene er satt sammen av. En bioinformatisk strategi for å identifisere den mest sannsynlige, romlige sammensetningen er utarbeidet og validert mot kjente strukturer. Denne metoden er også brukt på reseptorene fra lakselus, og nå gjenstår eksperimentell bekreftelse på at modellen også passer for disse. Vi håper dette arbeidet vil bane vei for en enklere bestemmelse av den romlige plasseringen også hos de andre artene, og eventuelt på andre reseptortyper.

Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediate chemical neurotransmission in the nervous system and at neuromuscular junctions in vertebrates. The natural transmitter is acetylcholine, but they are also the direct targets for neonicotinoids, some of the worlds largest selling insecticides. These chemicals are widely used against ectoparasites, arthropod vectors and agricultural pests. There are significant concerns regarding adverse effects of neonicotinoids on beneficial insects, and some neonicotinoids are now banned for out-door use in many countries. In-depth studies on the function of these receptors in arthropods are surprisingly scarce. Until 2020, no research groups had managed to express functional nAChRs in an ex-vivo system, using genes coding for both a- and ß-subunits from the target arthropod species. Co-expression of nAChR a-subunits from insects and ß-subunits from vertebrates (mainly chicken) had been the only feasible way of obtaining functional receptors with both subunit types in Xenopus laevis oocytes. In 2020, two groups independently overcame this hurdle, one being the applicant here. We managed to express two nAChRs from the marine arthropod Lepeophtheirus salmonis into Xenopus laevis oocytes using genes from this species only. In this project, these results will be used to attempt cloning of nAChRs from other arthropods like bees, mites, ticks, and mosquitos and test their sensitivity towards natural transmitters, antiparasitic agents, pesticides and other compounds. Thus, the present project aims to lead to a greatly improved way of obtaining nAChRs from arthropods, with a switch from arthropod-vertebrate chimeric nAChRs to arthropod-specific native nAChRs. These nAChRs will further serve as tools for fundamental research on the function of the arthropod nervous system and serve as elegant models to determine the effect of various existing and novel compounds on these receptors from parasites, pests, and non-target organisms.