Unravelling fundamental mechanisms of bacterial exopolysaccharide catabolism for use in food and health applications

Bakterier produserer en rekke ulike kjemiske forbindelser som uttrykkes på celleoverflaten eller skilles ut i omgivelsene. Mange av disse forbindelsene er karbohydrater som spiller en viktig rolle i ulike biologiske prosesser. En viktig gruppe av disse karbohydratene kalles eksopolysakkarider (EPS), som blant annet bidrar til at noen bakterier blir glatte og slimete. EPS har viktige funksjoner for både bakterier og mennesker. For eksempel bruker sykdomsbakterier EPS i biofilmer for å unngå immunforsvaret og antibiotika. Bakterier som brukes i matproduksjon skiller ut EPS som gir viktige egenskaper som tekstur og stabilisering av matvarer. Bakterier i komplekse samfunn, som i tarmen vår, kan bruke EPS som signalforbindelser for kommunikasjon med andre bakterier eller mellom bakteriene og verten (mennesket). EPS produsert av tarmbakterier kan også fungere som næringsstoffer for andre bakterier og dermed påvirke sammensetningen av tarmfloraen. I dette prosjektet ønsker vi å lære mer om EPS, hvordan disse komplekse karbohydratene brytes ned av bakterier, og hvordan vi kan bruke EPS i nye mat- og helseapplikasjoner. Vi vil produsere store mengder ren EPS av forskjellige typer (både kjente og ukjente) i vårt lokale bioraffineri. Disse EPS-ene skal brukes som næringsstoffer for bakterier slik at vi kan identifisere hvilke bakterier som kan nyttiggjøre seg av dem. Ved å identifisere, analysere og tilegne oss enzymsystemene bakteriene bruker til å bryte ned EPS-ene, kan vi bruke disse, sammen med kjemiske metoder, til å lage nye EPS-molekyler med nye og nyttige funksjoner. Disse nye molekylene skal utvikles med tanke på bruk i flere nye applikasjoner, for eksempel for å endre sammensetningen av tarmfloraen (fra dårlig til god sammensetning), for å endre tekstur og smak i mat, og som nye antimikrobielle stoffer. Så langt har prosjektet vært en stor suksess. I løpet av den første halvdelen av prosjektet har vi klart å skalere opp produksjonen av flere melkesyrebakterier som produserer nye typer EPS. En slik skalering innebærer forforsøk i milliliterskala, pilotforsøk opp til en liter, og til slutt store fermenteringer i en avansert 100-liters fermenter. Dette har krevd utvikling av metoder for nedstrømsprosessering av store volumer, kombinert med analytiske metoder som størrelseskromatografi, monosakkaridanalyse og NMR-analyse for å bestemme renhet og struktur. Allerede nå har vi identifisert en helt ny EPS fra melkesyrebakterien Lactoplantobacillus pentosus, som både vil være en stor nyhet vitenskapelig, men som også kan ha potensiale som tilsetningsstoff i mat (for eksempel som prebiotika) eller som utgangspunkt for en ny type antibiotika Gjennom prosessutviklingen for å produsere og rense denne EPS-en har vi også oppdaget nye skånsomme metoder for å isolere celleveggspolysakkarider fra Gram-positive bakterier. Dette er noe fagfeltet har slitt med i mange år, hvor de fleste har brukt destruktive ekstraksjonsmetoder som delvis ødelegger polysakkaridene. Selv om studien ikke er publisert, er det allerede stor interesse rundt dette funnet blant våre samarbeidspartnere, og vi ser muligheten for et lite gjennombrudd når dette publiseres vitenskapelig (først vil vi vurdere om det er mulig å beskytte funnet). Når det gjelder studiene av hvordan EPS brytes ned i naturen forfølger vi dette i to retninger – enzymer for nedbrytning av det kommersielt tilgjengelige fortykningsmiddelet gellan gummi og enzymer for nedbrytning av vår nye EPS fra L. pentosus. Ved bruk av vår store ekspertise innen genomikk og proteomikk har vi nå identifisert mange enzymer som vi er i ferd med å karakterisere. Disse er viktige for oss da de skal brukes til å lage oligosakkarider som igjen skal benyttes til glykokonjugasjonskjemi for å lage fluorescerende substrater og potensielt antimikrobielle varianter. Syntesearbeidet er godt i gang, og vi har allerede produsert en rekke fluorescerende varianter av gellan gummi oligosakkarider. Disse brukes nå til å identifisere bakterier som kan nyttegjøre seg av gellan gummi som næringsstoff. Ved opptak av de fluorescerende sakkaridene vil bakteriene lyse opp, slik at vi kan isolere dem og sekvensere genomene deres for å finne ut hvem de er. Dette vil være svært nyttig og interessant for å forstå hvordan gellan gummi påvirker tarmfloraen, da dette stoffet brukes i mange forskjellige matprodukter. Prosjektet nyter godt av tverrfagligheten som spenner fra medisinsk mikrobiologi til organisk kjemi. Dette gir oss en konkurransefordel innen feltet og gir oss muligheten til å utføre forsøk og lage produkter som få andre kan. Dette gjør oss til en interessant samarbeidspartner, og vi har allerede utvidet nettverket til Frankrike og Skottland med aktive samarbeidsaktiviteter. Prosjektet har også vært aktivt involvert i utdanning av masterstudenter. Prosjektet er nå inne i sin mest produktive fase, og vi ser frem til neste fase hvor den vitenskapelige produksjonen vil øke og den første PhD-kandidaten vil fullføre.

Bacterial exopolysaccharides (EPS) represent a highly diverse group of biopolymers that are secreted by bacteria. Whereas hundreds of EPS structures have been characterized, few studies exist that have investigated EPS degradation and the enzymes involved. Due to the enormous diversity of EPS molecules, we thus hypothesize that there is a large gap in knowledge of EPS degrading and modifying enzymes. In the present project we will tap into this large reservoir of unexplored enzymes to increase our general understanding of EPS utilization in biological systems and, through an interdisciplinary effort, harness the acquired knowledge to generate novel biotechnological tools and applications. By utilizing an on-site biorefinery, multi-gram amounts of pure EPS from several bacteria will be produced and subsequently used as nutrient sources in bacterial cultivation screens. Here, an expected important outcome is knowledge on how EPS can alter the composition of the gut microbiota. By analysis of EPS degrading isolates or enrichment cultures by a combination of genomics and proteomics, enzymes involved in EPS degradation will be identified and subsequently cloned, expressed and characterized to reveal complete degradation pathways. These pathways are likely to contain multiple new enzyme families and activities. The characterized enzymes represent an EPS toolbox that will allow tailoring of EPS-oligosaccharides, that, by means of chemical synthesis, will be used to generate fluorescent glycoconjugates (e.g. fluorescent glyco-carbon dots) that in turn can be used to identify EPS-binding or degrading bacteria in complex microbial communities. Using the same chemical approach, novel antimicrobial compounds will be synthesized to specifically target EPS degrading pathogens identified earlier in the project timeline. Finally, EPSs and EPS-oligosaccharides will be screened for their immunomodulatory properties to unravel potential EPS-host interactions.