Genetics of multi-pathogen resistance in Atlantic salmon

Sammendrag av smitteforsøk med ulike patogener Salmonid alphavirus 3 (SAV-3) Embryonale celler fra chinook-laks (CHSE-214) ble brukt til å dyrke SAV-3-virus (GenBank: JQ799139). Omtrent 70 friske atlantiske laks presmolt, som veide 35 ± 10 g, kom fra Sørsmolts AS og ble transportert til våtlaboratoriet. Forsøket startet etter en uke med akklimatisering og formalinbehandling mot ektoparasitter. Fiskene ble injisert intramuskulært med 0,1 mL virus (1 × 10^6 TCID50/mL). En kontrollgruppe på 15 fisk, injisert med L-15 medium, ble holdt separat. Ved 2, 4 og 8 uker etter infeksjon ble det tatt vevsprøver av hjerte, bukspyttkjertel og muskel fra alle fiskene i SAV-3 gruppen og kontroll gruppen. Formalin-fikserte vev ble brukt til histopatologi, mens RNAlater-konserverte prøver ble lagret ved -20°C for estimering av viralt infisert genom i hjertet. Det ble brukt standard histologimetoder, inkludert parafininnstøping og H&E-farging. RNA ble isolert ved bruk av RNeasy-settet, og viralt genom ble påvist ved bruk av et kommersielt sett (AAT, Taiwan). Resultater: Laks smittet med SAV viste høy viral replikasjon i hjertet, fra 2 uker etter smitte, med en topp etter 4 uker og en nedgang 8 uker etter smitte. Histopatologiske endringer var tydelige fra 2 uker etter smitte, med en topp etter 4 uker og med begynnende helning? regenerering i bukspyttkjertelen 8 uker etter smitte. En smittemodell for SAV3 i atlantisk laks er etablert med definert smittedose og tidsforløp. Smittetest med PMCV (piscine myocarditis virus) Et PMCV-inokulum fra et utbrudd av CMS hos atlantisk laks, ble laget ved å homogenisere hjertevev som ble sentrifugert for å fjerne rusk, og som deretter ble overført til 2 mL rør som ble lagret ved -80°C. Fiskene ble injisert intraperitonealt med en 1:500 fortynning, etter å ha gjennomgått anestesi, og som deretter ble tilfeldig fordeling på ? (antall) kar. Resultater Hjerte- og nyreprøver ble tatt fra 24 fisk 4, 6, 8 og 12 uker etter smitte. Ved hvert uttak ble det også tatt en blodprøver fra hver fisk, etterfulgt av disseksjon av hodenyren for qPCR-analyse, og hjerteprøver for histopatologi og qPCR. Histopatologiprøver ble fiksert i formalin, parafininnstøpt, seksjonert ved 2-3 µm, og farget med H&E?. Grad av histopatologi i atrium og ventrikkel ble vurdert ved bruk av en 0-4 skala. Inflammatoriske foci områder? i hjertet ble vurdert ved buk av en skala fra 0 til 4. Hjerteforandringer ble funnet 4 uker etter smitte, økende etter 6 uker, og med en moderat økning fra 6 til 8 uker, og en topp etter 12 uker. Ved siste uttak hadde 95% av fisken histologi poeng >0, med et gjennomsnitt på 2,6 poeng for atrium og ventrikkel. En smittemodell for PMCV i atlantisk laks er etablert med definert smittedose og tidsforløp. Smitteforsøk med lakselus Et forsøk ble gjennomført med atlantisk laks i 3 kar, 25 fisk per kar og vanntemperatur 10-11 °C. Smitten ble utført ved bruk av copepoditter fra ILAB (Industry Laboratory), Bergen. Fisken ble eksponert for 30 copepoditter per fisk i 30 minutter i stillestående vann mens oksygenmetningen i vannet ble holdt over 80% ved å tilføre oksygen. Fisken i hvert ble overvåket daglig. Antall lus per fisk ble talt 11 dager etter smitte på et tilfeldig utvalg av 3 fisk per kar. På de gjenværende fiskene ble antall lus per fisk talt 30 dager etter smitte, hvor også forskjellige utviklingsstadier av lusene ble bestemt. Infeksjonsnivået var 66-67% med liten variasjon mellom karene, og med en relativt jevn utvikling av fastsittende (chalimus-II) og preadult lus og en lik fordeling av kjønn. Forsøk ble gjentatt to ganger med sammenlignbare resultater. En smittemodell for laks med lakselus er etablert med stabile infeksjonsnivåer og utviklingsstadier av lus. AGD-prøver fra naturlig utbrudd Mucusprøver fra gjellene til 201 fisk under et naturlig AGD-utbrudd ble samlet inn for 16S rRNA mikrobiomsekvensering. Fiskene ble også vurdert for gjelletilstand på både venstre og høyre side. Sekvenslesningene ble behandlet ved bruk av DADA2-pipelinen, med avkortningslengder satt til 240bp for fremoverlesninger og 220bp for bakoverlesninger. Kun amplicon-sekvensvarianter (ASVs) innenfor det forventede lengdeområdet mellom 400 og 410bp ble beholdt. Etter taksonomi-tilordning ble ASVs klassifisert som kloroplaster og mitokondrier fjernet. Resultater Vi fant ingen signifikante forskjeller mellom gjellescore og mengden eller variasjonen av mikrober. Dette kan skyldes datatap og en ujevn fordeling av data over gjellescore, noe som reduserte den statistiske styrken, eller det kan indikere at mikrobefellesskapet ikke påvirker de målte gjellescorene. I tillegg undersøkte vi spesifikt bakterier som er kjent for å påvirke gjellehelsen fra andre studier, men disse viste heller ingen signifikante forskjeller mellom gjellescore-kategoriene.

In aquaculture, disease resistance plays an important role in the overall sustainability and profitability of the industry. Resistance to specific diseases, evaluated based on survival under a challenge test with a specific pathogen, is part of the breeding objectives for many Atlantic salmon breeding programs. However, when there is an outbreak, it is common for fish to be infected by multiple pathogens simultaneously, and genetic correlations of resistance to different diseases are low to none. Selective breeding to increase host resistance to multiple disease pathogens in interaction with each other will be very important for mitigating the impact of diseases. Furthermore, the current disease challenge models are designed with a high dose of pathogens to achieve at least a 50% mortality rate. This is far from what the fish experience in the production environment. The project will develop and optimize a multi-pathogen challenge test for CMS, PD, AGD, and Sea lice. Further, the proposal will study the genetics of multiple disease resistance in salmon and determine both specific resistance to one disease when other pathogens are present and the general coping of each fish with a complex pathogen load. This paves the way for the development of coinfection-resistant fish through genetic improvement. The mechanisms and gene markers of resistance to multiple infections will be studied by gene expression analyses. The ethical and social implications of establishing and implementing a multi-pathogen challenge test will be determined through a dynamic RRI (responsible research and innovation) process. The project will create a knowledge base and example for the industry regarding mitigation of the impact of disease through genetic improvement for coinfection resistance, this will greatly improve the bio-economy and welfare of Atlantic salmon production.