Decoding the intracellular complement system in inflammatory reactions

Vi har tidligere vist at intracellulært komplement, spesielt C5 systemet, bidrar til NLRP3 inflammasome aktivering når monocytter og makrofager utsettes for faresignaler. Den eksakte mekanismen for hvordan intracellulært komplement regulerer inflammasjons responser har ikke blitt etablert i detalj. I denne rapporteringsperioden har vi identifisert intracellulære kilder av C3 splitt produktene C3a, C3b og C3c i humane makrofager noe som kan tyde på en konvertase aktivitet, eller en annen protease som kløyver C3. Av interesse har vi observert en ko-lokalisering av antiC3bc og ASC-flekker. Slike flekker er kjennetegn på inflammasom aktivering. C3bc antistoffet gjenkjenner en neoepitop på C3c delen av C3b etter at C3 er kløyvd, og som beholdes på C3c etter kløyving av C3b. Ve har generert og karakterisert C3, C3aR, C5 og C5aR1 knock out (KO) THP1 monocytt celle linjer. Dette er essensielle forskningsverktøy for vår forskning på intracellulært komplement og deres funksjoner i inflammasjons reaksjoner. Vi har gjort forsøk som underbygger en rolle av C3 i inflammasjons reaksjoner; preliminære data med C3KO THP1 celler viser en redusert IL-1beta produksjon ved NLRP3 inflammasom aktivering med lipopolysakkarid (LPS) og nigericin behandling. Også andre cytokiner som IL-6 og IFNbeta er regulert av C3 i disse cellene. Videre viser preliminære data fra THP1 C5 og C5aR1 KO celler at IL-1beta er redusert ved inflammsom aktivering i KO celler sammenligner med villtype celler. Infeksjon av KO celler med M- tuberkolosis førte også til en lavere celledød og IL-1beta frigjøring sammenlignet med kontroll cellene. Disse resultatene viser klart en viktig rolle for intracellulært C3, C5 og C5aR1 i inflammasjons reaksjoner i humane makrofager. Et annet aspekt av prosjektet har vært å etablere hvilken rolle Rab11-FIP2 (FIP2) har i inflammasom aktivering og hvordan den kontrollerer traffikering av C5aR1. For at Rab11 skal utføre sin motorfunksjon og transport av endosomer inne i cellen, må den bindes til FIP2 som fungerer som et effektor protein for Rab11. FIP2 utfører transport av kargo langs aktin filamenter. Vi har i perioden generert en mengde data som viser at FIP2 har en essensiell viktig rolle for NLRP3 oppbygging og aktivering, og vi har også avdekket mekanismer som forklarer mye av denne FIP2 effekten. I denne rapporteringsperioden har vi også rekonstituert C5aR1 KO THP1 celle linjen med GFP-C5aR1. Foreløpige data vise at C5aR1 som er merket med GFP lokaliserer seg til forventede steder i cellen slik som plasma membranen og intracellulære kompartment som mitokondrier. Vi har også fått indikasjoner på at GFP-C5aR1 ko-lokaliserer med FIP2, også på mitokondrier. Dette systemet vil bli et viktig verktøy i prosjektet for å avdekke FIP2 sin rolle i trafikkering og funksjoner av C5aR1 på mitokondriene.

The liver-derived and plasma-circulating complement system is a key member of the host’s repertoire of pathogen- and damage-associated molecular pattern (PAMP and DAMP) sensors. Pathogen sensing in blood triggers activation of C3 (complement component 3) into C3a and C3b and of C5 into C5a and C5b, by C3 and C5 convertases, respectively. These complement activation fragments together mediate the opsonization and removal of invading microbes, mobilization of immune cells, and induction of a general inflammatory reaction. Recent work has led to the unexpected discovery of a cell-autonomous, intracellularly active complement system, termed the complosome. We have just recently shown that macrophages have an intracellular C5 system and recruit intracellular C5a receptor 1 (C5aR1) for inflammatory responses after sensing of danger signals. Unexpectedly, C5aR1 mediates these inflammatory effects by interacting with C5a on the mitochondria. Our findings raise several new and important questions that need to be addressed. The project will explore intracellular trafficking mechanisms of C5a and C5aR1 that control mitochondrial reactive oxygen species production and inflammasome activation. We aim to find the signalling mechanisms used by C5aR1 on mitochondria, and the role of intracellular complement in bacteria-induced killing of macrophages. It will also be examined if the intracellular C5 system controls cytosolic immune sensing of DNA and RNA. Obtained results will have high general relevance and potential as it provides novel insight into mechanisms of how macrophages respond to sterile and infectious danger.