Struktur og funksjon av de aromatiske aminosyre hydroksylaser og deres sykdomsbaserte mutante former

PAH og TH er jern og pterin-avhengige enzymer som sammen med tryptofan hydroksylase utgjør en "superfamilie". De har store likheter mht. struktur og katalytisk mekanisme, men har ulik spesifisitet mht. den aminosyre som hydroksyleres. Rekombinante enzymer vil bli produsert i stor skala (i E. coli), en forutsetning for å kunne gjennomføre de enzymologiske, fysikalsk-kjemiske og røntgenkrystallografiske studier. Målet er å klarlegge den katalytiske mekanisme og spesielt reguleringen av den enzymatiske aktiv itet ved kooperativ binding av substrater. I PAH er denne kooperativiteten ledsaget av en endring i enzymets konformasjon. Prosjektet vil nytte overflate plasmon resonans analyser (SPR) for å studere konformasjonsendringene i sann tid ved binding av subs trater, substrat analoger og inhibitorer. I tillegg vil prosjektet vha. osmotisk stressmålinger bestemme antall vannmolekyler assosiert med aktiveringen av PAH. Det proteinkjemiske er en forutsetning for å bestemme krystallstrukturen av full-lengde formen e og deres substratkomplekser. Den begrensende faktoren her er fremstillingen av store mengder native proteiner og selve krystalliseringsprosessen, hvor et hovedproblem har vist seg å være en molekylær mikroheterogeneitet pga. en ikke-enzymatisk deamideri ng av labile asparagin residuer. En nærmere identifisering av disse asparaginer vil gjøre det mulig ved setespesifikk mutagenese å bytte ut asparagin med asparaginsyre residuer.