HESTEFORSK Forståelse av etiologien bak acquired equine polyneuropathy via studier av Schwanske cellekulturer H-18-47-409

To close in on the aethiology behind the disease acquired equine polyneuropathy (AEP), the main aim of the project was to establish a platform for studying the pathological changes, including the conspicuous inclusions, in the Schwann cells (SC) in nerves of affected horses. The project`s first sub-goal was to cultivate SC from equine healthy nerves. We have established a method and now have cell cultures from 10 healthy horses frozen. We have also successfully obtained cell cultures from nerves harvested as long as 19 hours after euthanasia. This enables sampling under field conditions. The next sub-goal was to culture SC from horses diagnosed with AEP. Nerve samples from 3 horses which had previously been affected with AEP 1 (2 horses) or 2(1 horse) times were the first to be sampled. On histopathology, all 3 showed continued nerve changes compatible with horses recovered from AEP, but no inclusions in the SC were detected. Cultivation of SC was successful from 2/3 of these horses and is now frozen. There has been a marked decrease in registered AEP horses during the project period. In 2019 and 2020, a total of 14 affected horses were registered in Norway, 8 of which were euthanized in the acute phase. We have received serum from 4 of them. In Sweden, there were a total of 4 cases in 2022 and 2023, one of which we received serum from. In the spring of 2023, one case was registered in Norway. This was euthanized after acute deterioration and nerve samples as well as serum was collected. Histopathological examination of the nerves demonstrated clear changes consistent with AEP, including SC inclusions. From this valuable material, we have now cultured and frozen SC, in addition to frozen nerve sections and cell pellets for further investigations. Analysis by flow cytometry was used to confirm the identity of fibroblasts and SC in the culture. Mixed cultures (SC and fibroblasts) are natural in nerve tissue, but purer SC cultures may be relevant in some studies. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) to separate SC from other cells in the culture requires antibody that binds specifically to equine tissue. This antibody recently became available and may be used in future experiments where purer cultures are required. With immune-fluorescence and immuno-electron microscopy of frozen sections, we have detected the gangliosides GM1 and GM2 in the equine SC`s membranes. We were also able to strengthen our previous preliminary results that serum from AEP horses and stablemates have significantly higher levels in the blood of IgM antibodies against specific gangliosides, including GM1 and GM2, than horses from stables without AEP. The results could be confirmed through IgM analyzes of new and old samples in our biobank with over 130 serum samples from AEP stables collected since 2009. To investigate whether serum from AEP horses can trigger a stress response in cultured SC, cells from healthy horses have been cultured with serum from healthy and affected horses respectively. Preliminary analyzes with flow cytometry indicate a greater proportion of cell death in cultures supplemented with diseased serum. In contrast, no difference was observed in the protein expression between the cultures, which was examined with fluorescence microscopy after labeling with BiP/GRP78 antibody. Conclusion: We have developed a method for culturing SC from horses and have now a large material of healthy and diseased cells and serum available for further studies. Flow cytometry works well to differentiate between SC and fibroblasts. Immunofluorescence and immune-EM on frozen sections have demonstrated GM1 and GM2 in SC in horses. There is significant difference in the IgM level against specific gangliosides, including GM1 and GM2, in serum from AEP-affected stables versus unaffected ones. The finding so far suggests an important humoral factor in the aethiology of AEP, but further studies are needed to draw conclusions.

Vi har lykkes i å etablere en metode for kultivering av Schwann celler fra hestenerver og har utviklet teknikk for flow cytometri som skiller Schwann celler fra fibroblaster. Som resultat av dette har vi nå cellekulturer nedfrosset på flytende nitrogen fra 10 friske hester og 3 som var, eller hadde vært, syke av acquired equine polyneuropathy (AEP). Videre har vi påvist at gangliosidene GM1 og GM2 fins i Schwannske cellers membraner hos hest. Sammen med funn av signifikant høyere nivå av IgM mot spesifikke gangliosider hos hester, inkludert GM1 og GM2, på staller med AEP kontra friske kontroller, åpner det for videre studier av en mulig autoimmun faktor i etiologien av AEP. Prosjektet har lagt grunnlag for en PhD stilling og de involverte har fått økt kompetanse innen fagfeltet nervepatologi og immunologi. Nye metoder har blitt utviklet som kan brukes videre i forskningen på AEP, men kan også overføres til andre aktuelle studier. Prosjektet har medført samarbeid med Statens Veterinärmedicinska Anstalt i Sverige og Ludwig-Maximilian universitet i München. Begge steder har det blitt knyttet nye kontakter og intensjoner om videre samarbeid. AEP er den vanligste polynevropatien hos hest i Norden og er en sykdom som har store dyrevelferdsutfordringer. Sykdommen har også store økonomiske konsekvenser for hesteindustrien, ettersom de hestene som overlever vil være ute av trening i måneder og år. Ettersom hester med alvorlig AEP ikke er transportable og oftest må avlives akutt på stallen, har ferskt forskningsmateriale vært vanskelig tilgjengelig hittil. Vi har nå etablert en metode for uttak i felt av nervevev til cellekultur, og kan dermed få verdifullt materiale til videre studier når en hest må avlives på grunn av sykdommen. Tidligere studier har pekt i retning av grovfôr som en potensiell årsak til AEP, noe som har medført store utfordringer for fôrprodusenter. Prosjektet har resultert i robuste metoder for videre undersøkelser av etiologien bak sykdommen, noe som har vært sterkt etterspurt av heste-eiere og fôrprodusenter.

Acquired equine polyneuropathy (AEP) er en dramatisk nervesykdom som rammer nordiske hester. Det er påvist karakteristiske histopatologiske forandringer i de perifere nervene på hester avlivet pga sykdommen. Disse inkluderer re- og demyelinisering, samt hypertrofi av perikaria og proteinlignende inklusjoner i de myelinproduserende Schwanske cellene. Hypotesen er at en ukjent faktor, muligens fra fôret, påvirker metabolismen i de Schwanske cellene og fremkaller forandringene. Det er nødvendig med videre studier for å kunne belyse årsaksforholdene, men begrenset tilgang på prøver har vanskeliggjort dette. Prøvene må tas ut i umiddelbar tilknytning til avlivning og mange AEP affiserte hester kan ikke transporteres til patologi-enheter. Prøver som tas ut er dermed svært verdifulle. Ved å dyrke Schwanske celler i kulturer vil dette problemet omgås fordi man kan fryse og tine dem opp igjen til videre undersøkelser. Metoden er alt etablert på NMBU for hund og vil benyttes i studien på hest.