Intracellular lifestyle of Francisella piscicida in Atlantic cod

Det vertebrate immunforsvaret består av en medfødt og en ervervet del som ved gjenkjenning av en invaderende mikrobe aktiverer eller inaktiverer ekspresjonen av et stort antall gener. Gjenkjenningsevne og type respons varierer mellom ulike arter i møte med ulike bakterier og virus. Bakterien Francisella noatunensis subsp. noatunensis (tidligere F. piscicida), forårsaker sykdommen francisellose hos torsk. F. noatunensis er påvist i både vill og oppdrettet torsk, og kan spres ved horisontal smitteoverføring. Sykdommen gir kroniske betennelsesknuter i indre organer der de immunologiske organene hodenyre og milt er spesielt utsatte. Disse inneholder en høy andel av makrofager, antatte målceller for bakteriereplikasjon. Ved å etablere in vitro cellesystemer har vi vist at bakterien infiserer primære makrofager fra hodenyre hos torsk. F. noatunensis er også i stand til å invadere en epitel-lignende cellelinje, og viser dermed bakteriens evne til å nå frem til makrofagene og infisere levende fisk. Kunnskap om intracellulær lokalisering av bakterier har stor betydning for hvilken del av immunforsvaret er viktig for bekjempelse av infeksjonen. Transmisjonselektron mikroskopi kombinert med bruk av indirekte immunfluorescens og grønne fluorescerende bakterier viste at F. noatunensis finnes intracellulært omsluttet av vakuoler i torskemakrofager i tidlig fase av infeksjonen. Senere i infeksjonen er vakuolemembranene delvis nedbrutte og bakterien finnes tilsynelatende fritt i cytosol, men omsluttet av små vesikler produsert av F. noatunensis. Dette indikerer en virulensmekanisme som bidrar til å bryte ned fagosomale membraner slik at bakterien unnslipper vakuoler og kan replikere i cytosol i makrofagene. Fremtidig bekjempelse og vaksineutvikling mot francisellose avhenger av økt kunnskap om torskens immunrespons. Vi har utviklet spesifikke assays for å detektere aktivering av ulike immunveier som inflammasjon, antibakterielle responser, humoral og celle-mediert immunforsvar. In vitro studier av makrofager infisert med F. noatunensis viste en svak aktivering av gener som øker inflammasjonsresponsen, og et høyere utrykk av et anti-inflammatorisk gen. Gener assosiert med celle-mediert immunforsvar ble også aktivert. In vivo infeksjonsstudier avslørte en betydelig kraftigere aktivering av inflammatoriske, antibakterielle gener og markører for celle-mediert immunforsvar, spesielt IL-12/IL-17 og interferon (IFN)g. Funksjonelle studier av IFNg viste at dette proteinet øker opptak av F. noatunensis i makrofager og kan dermed ha en nøkkelrolle i bekjempelse av infeksjonen. Torsk eksponert in vitro og in vivo for LPS isolert fra F. noatunensis hadde en betydelig svakere aktivering av immunforsvaret enn ved bruk av andre LPS typer. Tilsvarende viste komparative studier av torsk injisert med formalin-inaktiverte Vibrio anguillarum og Aeromonas salmonicida at immunresponsen var svakest ved F. noatunensis injeksjon. Strukturelle studier av F. noatunensis LPS avdekket likheter med den humanpatogene bakterien F. tularensis som også aktiverer immunforsvaret i lav grad. Dette kan tyde på at F. noatunensis har utviklet en ytre struktur som ikke lett gjenkjennes av torsken, og dermed aktiveres ikke immunforsvaret kraftig ved infeksjon. Tidlige publiserte studier har vist at LPS ikke stimulerer immunresponser i andre fiskearter, og eventuell stimulering skyldtes LPS-kontamineringer som peptidoglykan eller DNA. Vi har gjennomført omfattende in vivo og in vitro studier av torsk og effekten av ulike LPS typer og renhetsgrader for aktivering av immunresponser. Alle LPS-typer klassifisert som rene fra ulike kommersielle leverandører stimulerer immunforsvaret hos torsk. Deler av torskens immunforsvar skiller seg fra annen fisk, men våre komparative studier viser at både laks og torsk gjenkjenner rent LPS, og det er små forskjeller i måten immunresponsene genereres.

Francisellosis caused by the intracellular bacteria Francisella piscicida is today the biggest threat to Norwegian Atlantic cod aquaculture. Understanding the intracellular lifestyle of F. piscicida and the role of host immune responses are of vital impor tance to development of efficient prophylactics. The current knowledge is limited and this project aims at filling some gaps in this field. Host-pathogen interactions will be examined by performing in vitro studies with our unique cod cell line and primar y macrophages. We will establish invasion assays to study internalisation and the level of intracellular replication. Further, this assay will be used to examine whether infection is dependent on temperature and study adherence and uptake of bacteria into cells. The localisation of infection has implication for vaccine development and we aim to identify if F. piscicida reside within vesicles or in cytosol. We will perform basic structural studies of F. piscicida LPS and study the immune response to LPS. W e will also study aspects of immunity that are known to play a role in infection with intracellular bacteria. The main macrophage activating factor IFNg will be produced recombinant and its role in postponement of infection will be addressed, while studie s of IL-1b secretion will reveal its role as a signalling cytokine of infection. Humoral immunity has been suggested to take part in eradication of intracellular bacteria mediated through antibody opsonisation that facilitate uptake in cells. We aim to st udy if this is present in cod. Cell mediated immunity has been proposed as most important in intracellular infections and herein we will identify the T cell subtype that is activated by F. piscicida. Finally, we want to establish the RNAi technology to ga in functional knowledge of important proteins in the immune defense against F. piscicida. Together, these studies will provide vital knowledge of the intracellular lifestyle of F. piscicida and cod immune response