Characterisation of ISA HPR0 virus- and infection in Atlantic salmon

Ved oppstarten av dette prosjektet var det en akseptert hypotese at sjukdomsfremkallende (dvs virulent) ILA virus hadde utviklet seg fra ikke-virulent ILA HPR0 virus. I prosjektet har vi kombinert fagområdene patologi, virologi, og molekylærbiologi for å beskrive, og karakterisere ILA virus infeksjon hos laks med den ikke-virulente HPR0-typen, spesielt sett i forhold til infeksjon med virulent ILA HPR-del virus. Gjennom dette arbeidet var målet å finne funksjoner som skiller disse typene og dermed også identifisere viktige virulensfaktorer for ILA-viruset generelt. Ved å øke kunnskapen om forholdet mellom disse virustypene, ville vi også etablere nødvendig kunnskap for å kunne vurdere risiko for utvikling av ILA ved funn av HPR0 typen, og identifisere «drivere» for denne overgangen. Tidlig i prosjektet viste vi i et omfattende materiale fra Færøyene, at ILA HPR0 virus kunne påvises i +/- 10% av alle undersøkte gjelleprøver i sjøvannsfasen. Vi påviste også at infeksjonen affiserte mesteparten av fisken på en lokalitet, at den var forbigående, og at alle lokalitetene gjennomgikk en eller flere infeksjonsepisoder. I våre videre undersøkelser viste vi at ILA HPR0 virus ga en lokal infeksjon av epitelceller på fiskens slimhinner (Gjeller og hud). Sammenlignende undersøkelser viste at også vanlig ILA starter med infeksjon av slimhinner, men at infeksjonen så spredte seg til en generalisert infeksjon av endotelcellene som kler innsiden av hjerte og blodårene. I prosjektet utviklet vi også en helt ny metode for påvisning av den cellulære reseptoren for ILA-viruset. Ved hjelp av denne metoden, og kunnskap knyttet til viruset fusjonsaktivitet (se under), kunne vi forklare årsaken til dette infeksjonsforløpet funksjonelt. Vinteren 2014 ble det for første gang siden 2005, påvist ILA HPR-del virus på Færøyene i forbindelse med rutinemessig screening ved slakting. Infeksjonen viste ingen typiske tegn på ILA. HPR0 kilden til det nye viruset ble identifisert i anlegget som hadde levert smolt til den affiserte merden. Dette var første gang utvikling fra ikke-virulent HPR0 til virulent HPR-del virus ble påvist i felt, og dermed også en bekreftelse på HPR0-hypotesen. Videre undersøkelser vha full-genom sekvensering, og smitteforsøk, viste at den eneste forskjellen mellom de 2 virusene var delesjoner i HPR og en enkelt mutasjon i F-proteinet. Dette gjorde at viruset ble i stand til å forårsake en generalisert infeksjon med infeksjon av de samme cellene som ved virulent ILA HPR-del virus infeksjon, selv om viruset ikke fullt ut hadde utviklet evnen til å gi klassisk ILA. Ut fra dette, og andre feltobservasjoner, foreslår vi også at utvikling av høyvirulent ILA HPR-del virus er en stegvis prosess som inkluderer lavvirulente mellomformer. Ved hjelp av laboratorieforsøk der varianter av HE-, og F-proteinet uttrykkes i cellekulturer ved å introdusere genene som koder for disse proteinene (dvs transfeksjon), fant vi at disse 2 proteinene samarbeider når det gjelder virusets fusjonsaktivitet. Fusjonsaktiviteten er viktig for virus opptak i cellene i forbindelse med infeksjon, og også for hvilke celler som infiseres (celletropisme). Forsøkene viste også at HPR-delesjon og mutasjon i F-genet, som er karakteristisk for virulente ILA HPR-del virus, både påvirket fusjons aktivering, og aktivitet. Virus quasispecies hypotesen sier at virus opptrer i «svermer», dvs det vil være en dominerende genotype, men i tillegg er det små mengder av mange genetiske varianter som sikrer at virus raskt kan svare på forandringer i omgivelsene. Spørsmålet vi stilte oss var om vi kunne finne korresponderende HPR-del virus i en virus «sverm» dominert av HPR0 virus, og omvendt. Dette ble undersøkt vha såkalt «next generation sequencing» av prøvemateriale dominert av hhv HPR0 og HPR-del virus. Vi kunne ikke påvise en slik sammenheng i våre undersøkelser. ILA HPR0 virus har så langt ikke latt seg dyrke i cellekulturer i laboratoriet. Å kunne dyrke denne virustypen ville være til stor hjelp både for å undersøke, og karakterisere faktorer knyttet til utvikling fra HPR0 til HPR-del virus, og for utvikling av en smittemodell hos laks. Under dette arbeidet etablerte vi både primære cellekulturer, og nye cellekulturer fra gjelle og hud, men uten å lykkes med dyrkning av HPR0. Imidlertid, ble det i prosjektet etablert grunnkunnskap som peker ut retning både med tanke på dyrkning av ILA HPR0 virus, og etablering av smittemodeller i fremtiden, selv om noe grunnarbeid fremdeles gjenstår her. Prosjektet ga også viktig generell kunnskap slik som at vi under patogenesestudiene utviklet en badesmittemodell som gir en mer naturlig, og kontrollerbar smitte enn det som er benyttet tidligere. I forsøkene våre ble det også demonstrer relativt store mengder virus i svaberprøver fra gjeller og hud, noe som åpner for en effektiv prøvetaking som ikke skader fisken, og som kan være nyttig i forbindelse med bl.a. overvåkning.

Infectious salmon anaemia (ISA) is still a significant problem for the aquaculture industry in Norway due to direct losses of Atlantic salmon caused by disease outbreaks and the measures taken to control the infection. The severity of the disease is empha sized by the large ISA epidemics unfolding over the past two years within a small geographical region in the county of Troms, having great impact on local economy. In this project we will be investigating molecular-, functional-, pathological- and evoluti onary properties associated with low- or avirulent ISA virus (ISAV) HPR0 genotypes, assumed to be precursors of all virulent ISAV strains that cause classical ISA outbreaks. The main objective through this multidisciplinary approach will be to obtain new information that can aid in forming the necessary basis for evaluating important issues related to HPR0, like the risk of infection and its frequency of transition to virulence. Both the authorities and industry request more information concerning this is sue in order to be able to take appropriate protective measures, especially as recent findings have shown there is a higher HPR0 prevalence in the marine environment than previously assumed, thus causing interpretation problems related to ISAV screening. The investigations will span both genetic and functional aspects related to HPR0, focusing on determining factors that are required for virulence acquisition. Modified existing methodology, but also powerful new technological approaches, will be used to r each our objective. The project group has a large and increasing number of HPR0 positive samples at their disposal, both from Norway and the Faeroe Islands, providing a solid foundation for these studies. The results from the project will increase our kno wledge on ISAV genetic markers involved in virulence, and may provide a new basis for the development of genetically engineered vaccines against ISA.