3D protein structure, active site structure, and function of metallo- and radical proteins

Forskning gjort av Metallproteingruppen på IBV, UiO (med Raman instrument på KI og elektronspinnresonans (EPR) instrument på FI ved UiO), og ansatte på den Norsk-Sveitsiske strålelinjen (SNBL) i Grenoble, Frankrike, har gjennom de siste årene tatt en ledelse i å utvikle og bruke én-krystall spektroskopiske metoder i kombinasjon med proteinkrystallografi på synkrotroner. Det gjeldende prosjektet fokuserer på å videreutvikle disse metodene, og bruken av dem til å løse viktige biologiske spørsmål. En PhD student har vært ved Stanford Universitet (Kjemisk Institutt) i slutten av 2013 og det meste av 2014 for magnetiske studier av metallproteiner. En postdoktor var seks måneder i Grenoble/ESRF for å forberede det instrumentelle oppsettet på SNBL, med en videre utvikling av bruk av kombinert én-krystall spektroskopi og protein krystallografi. Røntgenkrystallografi på proteiner brukes for bestemmelse av proteinstrukturer, men kan ikke gi informasjon om protoneringen, oksidasjonstallet eller deres spinn-tilstand. For metall- og redoksproteiner er disse egenskapene avgjørende for å forstå deres struktur og funksjon. I løpet av det siste tiåret har det blitt lagt mer fokus på reduksjon av disse enzymene, indusert av røntgenstråling. Vi fokuserer på enzymer som er involvert i oksygenaktivering og elektrontransport, som er av de viktigste prosessene i livet. For å forstå prosesser som celleånding og fotosyntesen, er det viktig å forstå detaljene om elektrontransporten innen og mellom disse systemene. Oksygen aktiveres og benyttes i en rekke reaksjoner, f.eks. av kompleks IV i elektrontransportkjeden, der protongradienten for ATP-syntese produseres. Oksygen er brukt av cytokrom P450 for å oksidere og metabolisere en stor gruppe av naturlige substrater og medikamenter. Elektroner og oksygen brukes av ribonukleotid reduktase (RNR) klasse I for syntesen av deoksyribonukleotider. Alle disse proteinsystemene bruker redoks og/eller metallkofaktorer i sine reaksjonsmekanismer, og noen av dem inkluderer tyrosyl-, tryptonyl- og tiylradikaler. Prosjektet fokus på protein-protein interaksjoner og proteinkomplekser. Dr. Åsmund K. Røhr presentert en poster allerede i juli 2012, og ett annet gruppemedlem holdt et foredrag på konferansen Simultaneous Combination of Spectroscopies with X-ray Absorption, Scattering and Diffraction Techniques i Zürich. Prosjektet har ført til flere publikasjoner med høy impact factor (IF). Gruppen tok del i en publikasjon i det enestående tidsskriftet Nature, der krystallstrukturen av det medisinsk relevante haptoglobin-hemoglobin komplekset ble publisert. Vi bidro med vår kompetanse i UV-vis og Raman én-krystall spektroskopi, og studiene viste at komplekset var i sin oksygenerte tilstand. Vi har publisert en stor RNR review i tidsskriftet Coordination Chemistry Reviews med impact factor over 12, og vårt proteinkompleks av R2F/NrdF og NrdI fra Bacillus cereus RNR ble publisert i ACS Chem. Biol. (IF over 5). Studier gjort på RNR fra mus, menneske, karpe, Mycobacterium tuberculosis og Bacillus cereus, samt EPR- og Raman spektroskopiske studier av R2/p53R2/R2F/NrdF proteiner, i samarbeid med Stanford University og CNRS i Frankrike, ble publisert i tidsskrifter med IF over 3. Videre ble en oppfølgende EPR-studie publisert (også med IF 3), utført på et kobberprotein, med 3D-struktur tidligere løst ved Universitetet i Tromsø, i samarbeid med Universitetet i Bergen, som viste Cu(II) og to forskjellige Cu(II)-seter i det utskilte proteinet (MopE*) fra den metan-oksiderende bakterien Methylococcus capsulatus (Bath). Vi publiserte også EPR-data på kobberproteiner i samarbeid med NMBU i en god journal. Vi har også forbedret metoder for proteinproduksjon, som trolig vil føre til raskere proteinkrystallografiske studier. Vi publiserte den første strukturen av Bacillus cereus NrdH (tioredoksin BC3987) og foreslo en unik reaksjonsmekanisme for denne typen tioredoksiner i en journal med IF over 3. Sammen med Univ. i Rochester kunne vi vise med røntgendiffraksjon og mikrospektrometri (i en journal med IF 3,74) ulike orientasjoner av en hem Fe(III)-koordinert metionin, som forklarer dens dynamikk i samsvar med EXAFS/XAS studier med Stanford Univ. I tidsskriftet Chemical Communications (IF av 6,8) publiserte vi i samarbeid med CUNY i New York viktige funn som viser at hem-gruppen i KatG er tilgjengelig og åpen for substratet. Gruppeleder har holdt foredrag i Kina (2013), Taiwan (2014)og India (2017), samt på ZING og COST-konferanser. Vi har deltatt i flere internasjonale møter. To av våre masterstudenter; Susanne Monka og Bernt Wu, ble uteksaminert i 2015.En PhD student Marie Lofstad disputerade 3 Feb, 2017 med Stanford resultat og som første førfatter i Biochemistry (USA). Med bland annat Univ. i Wien har vi gjort kreft relaterade studier med Forsker Marta Hammerstad i Oslo (inskickad).

The aim of the project is to investigate structural features of oxygen or electron reactions in proteins containing functionally important iron/manganese/cobalt, and/or radical centers. We will study mono and other (per)oxygenases that can perform comple x reactions, and ribonucleotide reductases (RNR) with related proteins (e.g. NrdI, NrdH), well as cytochromes with unusual EPR properties that could indicate original electron and proton coupled radical (in RNR) transfer reactions. Monooxygenases, perox idases, oxygenases, RNR and heme proteins can have large medical importance, e.g. tetrahydrobiopterin dependent monooxygenases/ heme proteins nitric oxide synthase, RNR and myoglobin/hemoglobin mutations are all linked to illnesses. We plan to study: 1) t he ferryl versus hydroxy-ferryl species and radical formation in myoglobin 2) nitric oxide synthase and other oxygenases 3) peroxide/superoxide complexes in heme protein and from non-heme iron containing proteins; 4) mono-nuclear iron dependent proteins will be compared with di-nuclear proteins and/or with Mn, Co proteins; and 5) bacterial cytochromes with unusual electronic properties. 6) the Met-Tyr-Trp cofactor realation to reactive oxygen/peroxide derived species will be determined. Nitric oxide sy nthase, peroxidase-catalase KatG mutants are cloned and expressed in E. coli and carp RNR mutants will be obtained, while some proteins are isolated in native form. The long-term goal is the understanding of monooxygenase and radical chemistry important t o make rational drug or modulator design. We are developing a combination of techniques for proteins in solution and in crystal form. We have progress in EPR and resonance Raman studies of protein crystals. We continue to develop (HF EPR, single crystal v ibrational Mössbauer, Raman, EXAFS/XAS/DFT analysis) of radicals and metal sites also after irradiation, and under hypoxia/anoxia. The goals of this project strongly relate to sustainable development of our planet.