The Interactomics of DNA Repair and Genome Maintenance

Proteinene er både cellenes byggesteiner og "arbeidhester". Mange er enzymer som katalyserer cellenes biokjemiske reaksjoner. I de senere år har det blitt klart at svært mange proteiner kan ha funksjoner i flere ulike biologiske prosesser. Dette er mulig ved at proteinene ofte har ustrukturerte, dynamiske regioner som kan binde til flere ulike andre proteiner eller andre makromolekyler som DNA/RNA. De molekylære mekanismene som styrer hvilke interaksjoner som skal inngås er mangelfullt forstått, men i flere tilfeller vet en at såkalte post-translasjonelle modifikasjoner (mye kjemiske endringer som fosfat- , metyl- eller acetylgrupper som kovalent festes på proteinet) i eller ved den ustrukturerte regionen, er viktige. Slike modifikasjoner kan forårsake større strukturelle endringer som dirigerer nye interaksjoner. Vi har i mange år studert enzymet uracil DNA glykosylase (UNG2) som kutter ut den abnormale nitrogenbasen uracil fra DNA og derved hindrer mutasjoner. Uracil feilinnsettes ofte under DNA-replikasjonen (kopieringen av DNA før hver celledeling). UNG2 opererer derfor i nær kontakt med replikasjonsmaskineriet ved å binde til to ulike replikasjonsproteiner - PCNA og RPA. I tillegg kan UNG2 binde til andre proteiner i andre prosesser, blant annet HIV-1-proteinet Vpr. Vi har tidligere bestemt den tredimensjonale strukturen av den kompakte, katalytisk aktive delen av UNG2 og vist hvordan denne "flipper" uracil ut av DNA dobbelhelixen før uracil kuttes ut. I cellekjernen har UNG2 imidlertid en ca 85 aminosyrer lang N-terminal ustrukturert ende, som ser ut til å finregulere både enzymaktiviteten, DNA-binding og hvilke proteiner UNG2 skal interagere med. Her sitter også bindingssetene for PCNA og RPA og muligens interaksjonsområder for hittil ukjente proteiner. Da svært mange DNA-reparasjonsenzymer ser ut til å inneholde ustrukturerte, regulatoriske områder, ønsker vi å benytte vår grundige kunnskap om UNG2 og de proteiner UNG2 interagerer med, til å kartlegge de grunnleggende mekanismene som modifiserer slike regioner, og som derved finregulerer DNA reparasjonsprosessene. Vi har til nå oppnådd NMR-"assignments" av både det foldede og det "ustrukturerte" (intrinsic disordered) N-terminale domenet i UNG2. dette gir et "kart" over alle nuklei i proteinet og gjør det mulig å ekstrahere informasjon om interaksjonsoverflater og konformasjonsforandringer ved ulike betingelser. Et uventet funn ved assignment av det "ustrukturerte" domenet har vist at det inneholder en lang (semi)stabil alfaheliks. Denne delen medierer binding til RPA, og har gitt ny innsikt i hvordan denne viktige interaksjonen skjer. Blant annet er interaksjonsområdet større- og bindingsstyrken ca 10 x sterkere enn enn tidligere antatt. Vi vil nå gjøre simuleringsanalyser for UNG2/RPA-interaksjoner i samarbeid med våre partnere ved CNRS-IBS i Grenoble. Vi har også nylig startet et nytt samarbeid med en NMR-gruppe i København for å studere interaksjon mellom UNG2 og PCNA. PCNA interagerer med de ca 15 N-terminale residiene i UNG2 via et konservert (PIP) motiv, og UNG2 er således ideelt plassert ved DNA-replikasjonsgaffelen for raskt å fjerne feilinkorporert uracil. Et sentralt spørsmål her er hvordan UNG2 kan relokalisere fra PCNA, til RPA, som binder enkelttrådet DNA i front av replikasjonsgaffelen. Slike enkelttrådede regioner utvides rask ved stans eller pause i DNA-replikasjonen, og er svært utsatt for hydrolytisk deaminering av cytosin til uracil. I motsetning til feilinkorporert uracil, vil deaminerte cytosiner være 100% mutagene om de ikke blir reparert før replikasjonsgaffelen passerer skaden. Vi analyserer nå hvilke konformasjonsendringer som oppstår i hele N-terminalen ved binding til RPA/PCNA, og om de to motivene (PCNA og RPA-binding) innbyrdes påvirker hverandres struktur. Til slutt har vi foretatt isolering av UNG2-inneholdende proteinkompleks i B-celler før og etter stimulering til klasseskift-rekombinasjon (del av affinitetsmodningen av antistoff). Her har vi benyttet isotopmerking under cellekultur. Disse vil nå bli analysert med kvantitativ massespektrometri for å identifisere eventuelle ulikt bundede proteiner etter stimulasjon, samt post-translasjonelle modifikasjoner i proteinene som kan mediere dynamiske endringer i proteinenes bindingsegenskaper. Vi har også utført tilsvarende isolasjon av proteiner som binder deaminasen AID. AID induserer enzymatisk deaminering av cytosin til uracil i immunglobulingenene, og er essensiell under antistoffmodningen. AID og UNG2 virker her sekvensielt i prosessen, og identifikasjon av eventuelt felles proteiner i de to kompleksene kan her gi viktig informasjon om hvordan prosessen er strukturelt organisert.

The single most important factor for the correct functioning of genomes is that their coding information is maintained intact and transferred unperturbed to future generations. DNA repair is highly coordinated- and integrated with other fundamental cellul ar processes such as transcription, replication, cell-cycle control and apoptosis. Core elements of DNA repair has even been adapted as essential parts of the adaptive immune system in higher vertebrates. Thus, a fundamental understanding of the molecular mechanisms underlying genomic maintenance is central to our understanding of regulation of genomic function. The present project was initiated as a FUGE II-project in 2007, and has resulted in ground-breaking knowledge about the fine-tuning of DNA repai r itself and cooperation with other cellular processes. An emerging picture is that complex post-translational modifications, often in intrinsically disordered regions of DNA repair proteins, dictate assembly of downstream protein complexes with distinct functions at the DNA interface. Here we focus on processing of genomic uracil as a model system to study these mechanisms at the molecular level. This is substantiated by or findings that core proteins in genomic uracil-initiation (AID) and processing (U NG2) apparently constitute central switch-points in repair versus mutagenic uracil processing. At the cellular level this regulation is crucial, and several lines of evidence indicate that dysregulation of the balance between error-fre and mutagenic uraci l-processing is intimately linked to cancer, especially B-cell cancers. Our long-standing experience within genomic uracil processing, the accumulated expertise in protein PTM analysis at the Proteomics and Metabolomics Core Facility (PROMEC), our close c ollaboration with the K.G. Jebsen Center for Myeloma Research at IKM as well as our outstanding international collaborators, should contribute to a high likelihood of success within the project.