Illuminating glia in the intact brain

Prosjektet hadde som mål å avdekke mekanismer for signalering mellom stjerneformede gliaceller (astrocytter) og blodkar i hjernen. Vi benyttet 2-fotonlasermikroskopi og ultrasensitive genetisk kodete fluorescerende sensorer for deteksjon av intracellular Ca2+ og ekstracellulær glutamat sammen med intravaskulær tracer. Genkonstruktene for de genetisk kodete sensorene ble levert inn i hjernen ved stereotaktisk injeksjon av rekombinante adeno-assosiert virus og uttrykt i gliaceller og nevroner ved hjelp av cellespesifikke promotorer. I anesteserte forsøksdyr viste vi dynamikken i ioneforandringer ved en spesiell type depolarisering av hjernebarken kalt «cortical spreading depolarization» (CSD), og deres relasjon til endringene i arteriolediameter. Vi fant at Ca2+-økningen i gliacellene var assosiert med konstriksjon av arteriolene under CSD-bølgen, men at det ikke var noen Ca2+-økning samtidig med karutvidelsen eller den påfølgende, langvarige karkonstriksjonen. Vi kunne derfor konkludere med at Ca2+-signaler i gliacellene ikke forklarer opphør av nevrovaskulær regulering slik man ser ved kraftig depolarisering av hjernebarken. Funnene kaster nytt lys over vaskulær dynamikk og nevrovaskulære reguleringsmekanismer. Vi studerte også hvordan gliaceller i tinninglappens hippocampus responderer på synaptisk aktivitet. Vi stimulerte nervecellenes aksoner og målte gliacellenes respons med Ca2+-sensorer. Vi viste da at Ca2+ konsentrasjonen økte i alle deler av astrocyttene inkludert utløpere rundt blodkar. En interessant observasjon var at astrocyttenes tynne forgreninger rundt synapsene responderte først og med størst amplitude på signalene. Ved å benytte ulike inhibitorer for receptorer antatt å være på astrocyttene konkluderte vi med at Ca2+-økningen ved synaptisk aktivitet var avhengig av frigjort glutamat og ATP. Samtidig viste vi med farmakologiske verktøy at Ca2+-økningen i astrocyttene skyldtes Ca2+-frigjøring fra intracellulære lagre. I et ennå upublisert arbeid viste vi ved hjelp av gen-knockout-teknologi at Ca2+-frigjøringen fra astrocyttenes intracellulære lagre var mediert av receptoren IP3R2. Dette var også tilfellet i de tynneste gliacelleutløperne som mangler slike lagre, hvilket tyder på at Ca2+-økningen i her skyldes diffusjon av Ca2+ fra større utløpere. Vi viste også at tetanisk stimulering av aksonene halverte latenstiden for astrocyttene. Mekanismen for forkortet latenstid er ukjent, men kan bero på at gliacellenes respons er knyttet til mengden glutamat eller kalium i synapsespalten. Vi studerte derfor nærmere kinetikken for glutamatendringene i ekstracellulærrommet ved synaptisk aktivering. Ved hjelp av sensorer på celleoverflatene kunne vi vise at ekstracellulær glutamatøkning ved synaptisk aktivitet varte mindre enn 50 millisekund og at selv tetanisk stimulering ikke ga annen glutamatøkning enn den umiddelbare som skyldtes nevronalt utslipp. Vi konkluderte derfor med at det ikke var noen påvisbar Ca2+-avhengig glutamatfrisetting fra gliacellene. I en separat artikkel viste vi at de aktivitetsinduserte Ca2+ signalene i gliacellene var patologisk forhøyet i en musemodell for tinninglappsepilepsi og diskuterte hvordan dysfunksjonen av gliaceller medvirker i patogenesen. I prosjektperioden etablerte vi også protokoller for monitorering av cellulære Ca2+- signaler og ekstracellulære glutamatendringer i hjernebarken på våkne forsøksmus. I våkne forsøksdyr fant vi at det var livlig Ca2+-aktivitet i astrocyttene. Tilsynelatende spontane, kortvarige signaler forekom lokalisert, typisk i bare en liten astrocyttforgrening, og asynkront med signalene i resten av cellen. Slike signaler forekom også i astrocyttenes utløpere rundt blodkar. Under motorisk aktivitet så vi derimot synkrone signaler i multiple astrocytter, med alle celledeler involvert. Foreløpige resultater tyder på at disse signalene ikke er særlig påvirkbare av sensoriske inntrykk og vi har holdepunkt for at de stimuleres av nevromodulatoriske fibre. Da kraftige depolariseringsbølger (CSD) ble indusert på våkne forsøksmus, så vi den samme sekvensen av ioneforandringer som vi rapporterte på anesteserte mus. En viktig forskjell var imidlertid at CSD-bølgende spredte seg mye raskere, og at latenstiden mellom nevronale Ca2+-signaler og ekstracellulær glutamatøkning var raskere. Dessuten kunne vi sannsynliggjøre at også gliacellene frigjorde glutamat ved slik kraftig depolarisering, trolig på grunn av celleoppsvulming og Ca2+-avhengige mekanismer. Samlet sett har dette prosjektet således bidratt til å identifisere signaleringsmekanismer mellom nevroner, gliaceller og blodkar. Funnene øker vår forståelse av samspillet mellom hjernecellene, deres aktivitet og endringer i hjernens blodtilførsel. På sikt kan resultatene bidra til utvikling av nye legemidler mot epilepsi, migrene og andre nevrologiske sykdommer.

A number of neurological diseases for which current therapies are nonexisting or inadequate involve deficiencies in glial cell function. Examples are Alzheimer's disease and stroke. The Nobel-recognized discovery of aquaporins - the channels that mediate rapid and regulated transport of water across plasma membranes - opened up a new field in molecular medicine. The applicant pioneered the research on aquaporins in the central nervous system and disclosed that aquaporin-4 (AQP4), the predominant brain aqu aporin, is concentrated in specialized glial membranes at the brain-blood interface. Despite a decade of intense research the roles of glial water channels are an enigma. The project utilizes emerging technologies, two-photon microscopy and optogenetics, to unravel novel roles of AQP4 and perivascular glia. The concepts launched are that perivascular glial membranes serve as a diffusion barrier for solutes entering and leaving the brain, and that Ca2+ signals in glial microdomains govern the activity of c ontractile cells in blood vessels and thus cerebral perfusion. Light-induced manipulation of select brain cell types will be utilized to crack the code of neuronal-glial-vascular communication. The project will take advantage of optimized genetically enco ded Ca2+ indicators delivered into the brain of living animals by viruses. The project is multidisciplinary and draws on the expertise of a national and international competence network including the EMBL Partnership for Molecular Medicine, Centre for Mol ecular Biology and Neuroscience, one group at Max-Planck Institute for Medical Research, Heidelberg, Germany, and two US groups.